HPLC实验流程分析和总结.docx

一、准备工作

进样小瓶：（1）无水乙醇浸泡过夜（2）自来水冲洗8次以上，再用滤过的娃哈哈矿泉水清洗数次（3-8次）（3）烘干，待用。

色谱级甲醇溶液、色谱级乙腈溶液及娃哈哈矿泉水用砂芯滤器过滤。注意：

先过滤娃哈哈矿泉水：先用自来水清洗砂芯滤器，再用娃哈哈清洗砂芯滤器。水相滤膜（两层，0.45um）用娃哈哈水湿润后，放在砂芯上，按图片装好滤器装置。先倒入少量娃哈哈水，看是否有漏液，如没有可大量加入娃哈哈。滤完后，将水重新装入瓶中。

滤甲醇：将滤器先用自来水清洗一遍，再用甲醇润洗一遍。用两层有机相滤膜(0.45um)过滤。

滤乙腈：将滤器先用自来水清洗一遍，再用乙腈润洗一遍。用两层有机相滤膜(0.45um)过滤。

将滤好的溶液，盖旋松，放入超声清洗仪中超声10分钟，以赶走溶液中的气泡。超声结束后，拧紧瓶盖。

清洗滤器，收好。

二、HPLC

仪器的打开

从上往下打开HPLC仪器

打开泵的开关

打开电脑及Instrument1online软件。（最好等HPLC仪器自检结束后再打开软件。）

冲洗系统

换A、B相：A相为水，B相为甲醇；探头要置底

打开排气阀，以排出系统内的气泡。设置流速为3ml/min，AB相各50%。看1、2、A、B管路有无气泡。待排完气泡后，流速调为0ml/min，关上排气阀。

把B相调为100%，流速慢慢往上升（先0.3ml/min，后0.6ml/min，最后1ml/min）。压力稳定就网上调。

流速打到1ml/min后，冲洗10min。

待压力线和UV检测线平行后，慢慢降低流速（先从 1ml/min到0.6ml/min，再到0.3ml/min，最后0ml/min。）

冲洗柱子

接色谱柱及预柱。如图。注意方向。预柱是大头进，小头出；色谱柱看箭头，箭头指向流出的方向。

接完柱子后，慢慢往上调流速1ml/min（先0.2，再0.4，再0.6，再0.8，最后1ml/min），直至两条线平行（检测线和压力线），线平行后至少要平行5min，才可以往上调。当流速1ml/min，且线平行5min后，慢慢降低流速至0（先1ml/min到0.8，再0.6，再0.4，再0.2，最后0ml/min）。

样品的检测

将甲醇换为乙腈，流动相比例调整为，30%B及70%A。将流速慢慢往上调至1ml/min

（先0.2，再0.4，再0.6，再0.8，最后1ml/min），直至两条线平行。设置检测的参数、保存方法，开始检测样品。

样品检测完后，慢慢降低流速至0（先1ml/min到0.8，再0.6，再0.4，再0.2，最后0ml/min）。

更换流动相，将乙腈换为甲醇，调整流动相比例，先B10%，流速慢慢上升（先0.2，再0.4，再0.6，再0.8，最后1ml/min），冲洗系统至两线平行，流速慢慢降至0ml/min。再调整流动相比例为B100%，流速慢慢上升（先0.2，再0.4，再0.6，再0.8，最后1ml/min），冲洗系统至两线平行，流速慢慢降至0ml/min。卸柱。

从下往上关闭HPLC仪器。