WB实验步骤分析和总结.docx

实验材料：

蛋白电泳（制胶、SDS电泳）

SDS凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDSLoadingBuffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水

实验仪器、耗材：

蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用）

配制溶液：

配制10%APS溶液：-20度保存

0.5gAPS+5ml蒸馏水、2.5gAPS+25ml蒸馏水

配制200ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-GlycineSDS（ph8.3,10×）

20mlTris-GlycineSDS+180ml蒸馏水

配制1mlloadingbuffer：

200ul5×loadingbuffer+800ul蒸馏水实验步骤：

一．制胶：

参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。

根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。

SDS分离胶的浓度与最佳分离范围

SDS

SDS分离胶浓度

6%胶

8%胶

10%胶

12%胶

15%胶

最佳分离范围

50-150kD

30-90kD

20-80kD

12-60kD

10-40kD

配制10%分离胶：

将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

配制SDS分离胶

所需各组分体积（单位：

所需各组分体积（单位：ml）

分离胶

凝胶

浓度

体积

30%Acr-

双蒸水

Bis(29:1)

分离胶缓冲液

（4×）

10%APS

TEMED

5ml

2.08

1.67

1.25

0.05

0.002

10ml

4.17

3.33

2.5

0.1

0.004

15ml

6.25

5.0

3.75

0.15

0.006

20ml

8.3

6.7

5

0.2

0.008

10%待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟至1小时。

10%

待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。

配制5%浓缩胶：

所需各组分体积（单位：ml）凝胶

所需各组分体积（单位：ml）

凝胶

30%Acr-Bis(

浓缩胶缓冲液

10%AP

TEME

体积

双蒸水

29:1)

（4×）

S

D

2ml

1.14

0.34

0.5

0.02

0.002

4ml

2.28

0.68

1

0.04

0.004

6ml

3.42

1.02

1.5

0.06

0.006

8ml

4.56

1.36

2.0

0.08

0.008

将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。注意：灌胶速度要快，防止凝胶。

将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。

待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。

二．SDS电泳:

在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。

制备样品：

1）蛋白样品：

根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。

蛋白提取液

蛋白提取液+5×上样缓冲液+蒸馏水，上样量为40-60ug。

制备的样品，煮沸5分钟，12,000rpm离心5分钟，取上清，上样。

泳道样品

泳道

样品

1

Marker

2

样品1

体积

10μl

20μl

3 4 5 6 7 8 9 10

样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品

2 3 4 5 6 7 8 9

20μl 20μl 20μl 20μl 20μl 20μl 20μl 10μl

电泳：浓缩胶80V，约20分钟，分离胶100V，约1小时。

一、考马斯亮蓝染色

注：将提取的植物蛋白进行电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色。全细胞裂解液电泳后，进行

westernblot检测。

将电泳后的PAGE胶取出放入容器中，加入适量蒸馏水（以充分覆盖PAGE胶为宜），加热至沸腾后5分钟，弃去蒸馏水；

加入适量考马斯亮蓝染色液（液面覆盖凝胶即可）加热至沸腾后5分钟，弃染色液；

加入适量蒸馏水，加热至沸腾后5分钟，弃蒸馏水，重复此步骤至背景清晰。

观察拍照。

WesternBlot

溶液配制：

配制500ml 1×TBST溶液：

50mlTBST（ph8.3,10×）+450ml蒸馏水

配制100ml 5%牛奶封闭液：4度保存

5克脱脂奶粉+100ml 1×TBST

配制100ml转膜缓冲液（甲醇）：CW0044 Tris-Glycine（ph8.3,10×）

10m