蔬菜产地土壤和产品中抗性因子的健康风险评价技术规范.pdfVIP

蔬菜产地土壤和产品中抗性因子的健康

风险评价技术规范

1范围

本文件规定了蔬菜产地土壤和产品中抗性因子的健康风险评价的术语和定义、设备和材料、试验程

序、样品采集和制备、测定分析及判定规则。

本文件适用于蔬菜产地土壤和产品中抗性因子对人类健康危害风险的定性分级评价。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB4789.1-2016食品微生物学检验总则

GB19489-2008实验室生物安全通用要求

HJ/T166-2004土壤环境监测技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

抗性因子

又称耐药性决定因子或抗生素耐药基因（ARG），指微生物编码的可以对抗菌药物产生耐药性或敏

感性下降的基因。

健康风险

是指抗性基因通过土壤传递给蔬菜产品，进而可能对人类健康造成风险。

移动元件

是指携带抗性因子的可移动遗传元件，包括整合子、转座子、质粒、基因岛等。

ESKAPE病原菌

包括屎肠球菌(E)、金黄色葡萄球菌(S)、肺炎克雷伯菌(K)、鲍曼不动杆菌(A)、铜绿假单胞菌(P)

和肠杆菌科细菌(E)。

4设备和工具、材料

设备

——均质仪；

——Nanodrop核酸浓度测定仪；

——微量移液器：0.1μL～2.5μL、1μL～10μL、10μL～100μL、100μL～1000μL；

——电子天平：感量0.001g；

——水浴锅；

——生物信息学服务器。

工具和材料

1

——铁铲、圆形取土钻；

——无菌采集袋；

——剪刀；

——商品化土壤DNA提取试剂盒。

5试验程序

蔬菜产地土壤和产品中抗性因子人类健康风险分级试验流程如图1所示。

图1蔬菜土壤抗性因子人类健康风险分级试验流程

6样品采集和制备

样品采集

6.1.1土壤

为了保证样品的代表性和随机性，每个土壤单元设3个～7个采样区，单个采样区是自然分割的一个

田块，每个采样区的样品为蔬菜土壤的混合样，参照HJ/T166-2004，可采用对角线法、梅花点法、棋

盘式法、蛇形法设计样品点，采集土壤的深度为10cm左右，每个点采集土壤1g,混合均匀后作为1个样

本，放入无菌采样袋中，标记信息，密封后-20℃冷藏。

6.1.2蔬菜

采集不同类型蔬菜的对应食用部分（果实或茎叶等），每种类型的蔬菜采集10g，将其放入无菌袋

中，标记信息，密封后-20℃冷藏。

样品运输

采集的样品按GB4789.1要求运达检验单位，运输时间不超过24h，运输工具应保持清洁，运输过程

中应防止包装破损导致样品渗漏。

样品制备和保存

样品运回实验室时，应确认样品完好情况。

对于土壤样本，不用进行预处理可直接提取总DNA。对于蔬菜样本，需要进行样本预处理。用已灭

菌的Milli-Q水清洗蔬菜，直至眼观达到家常做菜洗菜的清洁程度，加入500mL0.85%无菌生理盐水，

置于摇床震荡15min。震荡产生的洗液过0.45μm滤膜收集菌体，用真空泵抽干后置于-80℃以备总DNA

的提取。

7测定分析

2

样本总DNA提取及测序

使用商品化土壤总DNA提取试剂盒提取土壤和预处理后蔬菜样本的总DNA，使用nanodrop仪测定所提

取总DNA的浓度和纯度，经测定需要满足总DNA含量2μg，同时OD260/OD280介于1.6～2.0之间。将检测

合格的DNA样本送至测序公司进行二代宏基因组测序，每个样品测序的数据量为10G。

宏基因组数据拼接、注释和分析

使用本地生物信息学分析平台或委托生物技术公司开展宏基因组数据的拼接、注释和分析。

原始数据质控：根据Index序列区分各个样品的数据，提取出的数据以fastq格式保存，获得原始

数据raw