62-EB病毒(EBV)核酸检测标准操作规程(荧光PCR法).docx

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EB病毒〔EBV〕核酸检测标准操作规程

〔荧光PCR法〕

1.目的

标准EB病毒核酸DNA〔荧光PCR法〕检测操作流程，准确进展EB病毒DNA分析。2.应用范围

使用中山大学达安基因股份EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒〔荧光PCR法〕和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进展EB病毒DNA检测。

3.职责

由PCR试验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，试验室主管负责监视实施。4.内容

试验原理及其临床应用

本试剂盒用一对EB病毒〔EBV〕特异性引物和一条EB病毒〔EBV〕特异性荧光探针，配以PCR反响液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体〔dNTPs〕等成分，用PCR体外扩增法检测EB病毒〔EBV〕DNA。用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床供给参考，

标本采集

使用标本类型：全血。

标本采集；由合作单位依据以下要求进展采集。

全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，马上轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。

标本保存和运送：标本可马上用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送承受0℃冰壶。

试剂预备

供给商：中山大学达安基因股份。

此试验试剂应放在冰箱-20℃保存，在试验前5分钟取出备用，试验后应马上放回冰箱-20℃。

假设试剂消灭了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应准时更换。

质控品

质控品来源：随试剂盒，由厂家供给。

质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。

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质控频度：每次试验均需做质控。

操作过程说明

DNA提取

质控品处理：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心数秒，吸50ul至0.5ml灭菌离心管中，参与50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12023rpm离心5分钟，备用。

样本处理

取全血500ul至枯燥玻璃试管中，参与生理盐水500ul轻摇混匀；

取枯燥玻璃试管参与1ml淋巴细胞分别液；

将稀释好的全血用移液器缓慢参与加有淋巴细胞分别液的试管中(留意沿着管壁，速度要慢)；

2023rpm离心20分钟〔建议用水平离心机〕；

吸取白细胞层(从上往下其次层)，参与1.5ml离心管，12023rpm离心5分钟；

去上清，沉淀中参与50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12023rpm离心5分钟，上清备用。

4.5.2.1加样：取PCR反响管假设干，参与处理后的样品〔标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品〕上清液5ul,8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。

4.5.3PCR扩增

将预备好的PCR反响管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按以下循环参数进展扩增反响：37℃-2min；94℃-2min；〔94℃-15ses；55℃-45ses〕×40cyclics；

EBV检测荧光素：FAM; 反响体系：50ul；荧光信号收集：55℃-45ses，末端收集。

Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析

翻开计算机电源。

绿色。假设不是绿色而是红色，软件会提示将Mx3000P电源开关翻开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。翻开电脑上的Mx3000P

绿色

。假设不是绿色而是红色，软件会提示

，这时只需要连续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。

，这时只需要连续稍等片刻，待仪器自检完成，

4.5.3.3在软件的弹出框中选择您要进展的试验类型，通常选择第4.5.3.4确定卤钨灯已经翻开。

4.5.3.3在软件的弹出框中选择您要进展的试验类型，

通常选择第

4.5.3.4确定卤钨灯已经翻开。

(绿色)则说明卤钨灯已经翻开；

〔黄色〕则说明卤

钨灯正在预热；〔红色〕则说明卤钨灯没有被翻开，这时需要用鼠标点击这〔绿色〕。

钨灯正在预热；

〔红色〕则说明卤钨灯没有被翻开，这时需要用鼠标点击这

〔绿色〕。

4.5.3.6在里，对所选孔进展设定，在

4.5.3.6在

里，对所选孔进展设定，在Welltype中设定Standard

，10倍的浓度梯度可以直接点击〔标准品〕、NTC〔阴性比照〕、unkown〔样品〕等，并选择正确的荧光通道〔FAM,HEX,ROX，Cy5〕，参比荧光〔Referencedye〕选None。对于标准品，在Welltype中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。方法为：点击

，10倍的浓度梯度可以直接点击

，在下拉菜单中选择不同的系数关系后，依次点击设定为标准品一栏，手工输入浓度。假设要对不同的样品进展编号，则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击就能显