综合文案药学.pptx

Reference：RoscovitineTargets,ProteinKinasesandPyridoxalKinase

毛宇亲和色谱技术应用于小分子的靶标确证

AUTHOR:StéphaneBacha,MarieKnockaerta,JensReinhardta,OlivierLozacha,SophieSchmitta,BlandineBarattea,MarcelKokena,StephenP.Coburnb,LinTangc,TaoJiangc,Dong-caiLiangc,HervéGalonsd,Jean-FrancoisDiericke,LorenzoA.Pinnaf,FlavioMeggiof,FrankTotzkeg,ChristophSch?chteleg,AndreaS.Lermanh,AmancioCarneroh,YongqinWani,NathanaelGrayiandLaurentMeijerajPublishedonSep2,2005inTheJournalofBiologicalChemistryIF：4.600JCR类别BIOCHEMISTRYMOLECULARBIOLOGYJCR分区Q1Vol.280,No.35,IssueofSeptember2,pp.31208–31219,2005文献相关信息

亲和色谱技术AffinityChromatography概念：具有高度特异亲和性的二种物质之一作为固定相，利用与固定相不同程度的亲和性而建立起来的一种分离的色谱方法，也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。这个方法适用于能够进行修饰，但是生物活性不受影响的小分子；以及能被固定化的蛋白质大分子等。

亲和色谱技术原理AffinityChromatography·所有的分子，特别是蛋白质，有一个复杂的三维结构。?亲和层析利用配体具有识别大分子的结构能力来实现。?这种相互作用是非常特别的，配体只与某一个类型的分子相互作用（特异性、可逆性），也可设计成能与一类结构相似的分子作用。·生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体等亲和作用。

亲和色谱技术原理AffinityChromatography将配基通过共价键偶联到介质（载体）；配基与靶标分子吸附；洗脱目标物。

亲和色谱技术原理AffinityChromatography·配基偶联时存在的困难：小分子与蛋白之间的空间位阻以及小分子的非特异性结合而产生的疏水环境。我们可以通过在小分子与固相载体之间连上连接基团，提供足够的空间以阻止空间障碍的形成，便于反应基团与酶的结合以及对化合物的纯化。而非特异性结合通常可通过增加连接极性基团来避免。·亲和配基必须具备的条件：1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的2、结合常数要适当3、稳定性好，可进行化学修饰

亲和色谱技术原理AffinityChromatography理想情况是，在载体上的的配体与靶分子有良好的?亲和力。?但是亲和力太强也不行，?如果吸附太强会使它很难从柱子上脱附。1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用减弱或完成破坏。2、PH：在适当的PH下，亲和结合作用较高，在其它PH下，亲和作用减弱或完成破坏。3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱亲和作用4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱；但是，疏水性相互作用增强5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用减弱6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失洗脱方法：有特异性洗脱和非特异性洗脱。特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标产物。非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。

亲和色谱根据亲和色谱小分子探针的不同分为三类：Affinitypull-down,Activatedbasedproteinprofiling(ABPP),CapturecompoundsMassSpectrometry(CCMS).Affinitypull-down:探针与靶蛋白可逆结合，形成动态平衡，用洗脱液可以将非特异性蛋白洗脱，而结合蛋白需要用变性条件或者过量竞争剂将其洗脱，因此洗脱缓冲液的使用十分重要，洗脱能力差的洗脱剂会导致高的非特异性背景，而洗脱能力强的洗脱剂会导致一些亲和力