(正式版)B-T 40192-2021 刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法.docxVIP

ICSCCS

65.020.01

B16

中华人民共和国国家标准

GB/T40192—2021

刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法

DetectionandidentificationofColletotrichumCordausingreal-timePCR

2021-05-21发布

2021-12-01实施

国家市场监督管理总局

国家标准化管理委员会

发布

I

GB/T40192—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口。

本文件起草单位：中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国乌鲁木齐

海关、中国检验检疫科学研究院。

本文件主要起草人：段维军、蔡磊、刘芳、李雪莲、王肿、赵鹏、郭立新、张慧丽、张永江、陈先锋。

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GB/T40192—2021

刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法

1范围

本文件描述了植物病原真菌刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法。

本文件适用于携带刺盘孢属病菌的植物及其产品中刺盘孢属病菌的检测筛查。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于

本文件。

SN/T2589植物病原真菌检测规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4刺盘孢属的分类信息

中文名：刺盘孢属。

学名：ColletotrichumCorda。

根据《DictionaryoftheFungi》(第10版)(2008)分类系统，刺盘孢属隶属于真菌界(Fungi),子囊菌

门(Ascomycota),粪壳菌纲(Sordariomycetes),小丛壳目(Glomerellales),小丛壳科(Glomerellaceae)。

传播途径：刺盘孢属病菌主要由种子或病残体等传播，也可经风、雨水和昆虫传播。

5鉴定原理

根据刺盘孢属病菌的DNA序列特征，采用实时荧光PCR方法，应用所设计引物和探针对刺盘孢

属病菌进行检测鉴定。

6仪器设备、器具、试剂和培养基

6.1仪器设备和器具

高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、水浴锅纯水仪、涡旋振荡器、紫外分光光度计、高速冷冻离心机、冰箱、生化培养箱、实时荧光PCR仪、微量移液器(0.1μL～2.5μL、1pL～10μL、10μL～50μL、20μL~

200μL、100μL～1000μL)、锥形瓶、培养皿、载玻片、盖玻片。

GB/T40192—2021

6.2试剂

次氯酸钠、液氮、超纯水、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取液(2%CTAB,1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris·HClpH8.0)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、70%乙醇、核糖核酸(RNA)酶、实时荧光聚合酶链式反应(Real-timePCR)反应预混液：2×

TaqManUniversalPCRMasterMix。

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。

6.3培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):将200g马铃薯去皮，切小块，沸水煮20min后过滤，弃去滤渣，

在滤液中加入葡萄糖和琼脂粉各20g,加蒸馏水定容至1L。配成溶液后121℃下灭菌20min。

7检疫鉴定

7.1样品的采集与处理

样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。

7.2核酸的制备

采用基因组提取试剂盒制备DNA,或采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取法，十六烷

基三甲基溴化铵(CTAB)提取法按照附录A的方法制备。

7.3DNA纯度与浓度的测定

用紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别读取260nm和280nm处的吸收值，计为

OD??o、OD?so。DNA的纯度OD??o/OD?so比值应为1.7～1.9,DNA的浓度为50倍的OD??o(μg/mL)。

DNA的浓度与纯度应符合实时荧光聚合酶链式反应(Real