实时荧光定量PCR概述课件.pptVIP

实时荧光定量PCR卢瑶瑶、黄志聪佘碧芳、李家威

实时荧光定量PCR技术研究概述方法诞生应用原理问题

诞生实时荧光定量PCR(real-timefluorescencequantitativePolymeraseChainReaction,RTFQPCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新定量试验技术，即通常所说RT-PCR技术。

原理1、非探针类（SYBRGreenI法）SYBRGreenI是一种结合于双链DNA结合染料。与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

2、探针类（TaqMan探针法）

方法引物、探针的合成引物、探针的设计目的基因的查找和比对荧光定量PCR方法的确定1.反应体系的配置荧光曲线与标准曲线的制作2.反应条件的设定3.反应体系条件的优化标准品的制备待测品的制备通过标准曲线对数据进行分析

1、荧光定量PCR方法和荧光标记素的选择与确定按荧光产生的原理有两种方法：荧光探针法和荧光染料法。染料法利用SYBRGreen分子产生的荧光信号来进行样品定量。与常规PCR类似，唯一区别是在反应体系中加入了SYBRGreen染料分子。探针法：与常规PCR的不同之处在于：在上下游引物外还加入了让具有序列特异性的探针（探针本身具有荧光标记），该探针根据需要扩增的靶序列设计因此只能与待检测序列结合，与染料法相比，提高了实验的特异性。目前市场上探针多样，其中以TaqMan探针应用最为广泛。荧光素：FAM、Texasred、LC-Red640，LC-Red705等2、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对●从Genbank中查找并下载所需要的序列。●通过BLAST对该目的基因进行对比，找出保守序列。

3、引物的设计与合成：PrimerPremier5.0软件成功4、探针的设计与合成：DNAstar软件中的Seqman软件选择高品质的引物探针合成商。

5、标准品的制备(1）选择一个已知起始拷贝数（起始模板数）的样品(2）反应体系的配置(3）反应条件的设置(4）反应体系与条件的优化

(1)、反应体系的配置

(2)、反应条件的设定95℃预变性2min↓94℃变性30s↓55-65℃退火30s↓72℃延伸30s↓72℃终延伸5min扩增30-40个循环

(3)、反应体系和条件的优化?酶浓度?Mg浓度+?dNTP浓度?上、下游引物浓度?探针浓度?退火温度、退火时间和循环数?DNA模板浓度

6、荧光曲线与标准曲线的制作通过原理可知：总的荧光信号=本底信号+分子数×单位信号强度Rn=RB+X0(1+E)×RS

Rn=RB+X(1+E)×RS当n=CT值0时，荧光信号强度的变化的对数全部一致，都达到了阈值。RT-RB=X(1+E)×RS0lgX0CTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)-lgRSCT×a=-lgX0+b

7、待测品的制备将待测样品放置在与标准品相同优化后的体系、条件下进行PCR扩增反应。8、通过标准曲线进行数据分析待测样品的CT值可通过标准曲线方程CT×a=-lgX0+b求得待测样品的起始模板数,从而达到通过标准曲线对未知模板进行定量分析的效果。

荧光PCR的应用●分子生物学的研究1.核酸定量分析对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测,比如近期流行的甲型H1N1流感，转基因动植物基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。2.基因表达差异分析比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。3.SNP检测检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦SNP的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的SNP检测将会变得简单而准确。

4.甲基化检测甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症，Laird报道了一种称作Methylight的技术，在扩增之前先处理DNA，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的DNA，这种方法不