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用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定方法

专利名称：用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定

方法

技术领域：

本发明属实验方法领域，涉及体外细胞培养的测定方法，具

体涉及一种用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定

方法。该方法应用体外细胞培养的方式，将肾小球系膜细胞

直接作用于成骨细胞，在细胞水平观察两者的内在联系。本

发明还包括建立该方法的步骤和其应用领域。

背景技术：

中医理论认为，肾藏精。精,是构成人体和维持人体生命活

动的最基本物质。精生髓，髓居于骨中，促进骨的生长发育，

故肾具有“主骨生髓”的功能。中医古籍中记载“肾生骨

髓”(《素问·阴阳应象大论》)、“肾主身之骨髓”(《素

问·痿论)、肾“其充在骨”(《素问·六节脏象论》)。《圣

济总录诸痹门》大力提倡“补肝肾以壮骨”，强调补肾填精

药对骨及骨关节疾病的作用。目前，临床上多用补肾中药治

疗多种骨代谢疾病。当前对“肾主骨”现代机制进行的研究，

主要从钙磷代谢、激素(如活性维生素03)、细胞因子(如骨

形态发生蛋白BMP7)及神经内分泌等方面，间接证实“肾主

骨”的现代理论依据。中医所说的肾是从功能上定义，包括

了现代医学上的人体器官一肾脏，肾脏是“肾主骨”理论体

系的主要器官。胚胎学等方面的研究证实，肾与骨均发生于

中胚层，属于同源器官；肾小球系膜细胞是肾小球的主要固

有细胞之一，具有分泌多种生物活性物质的功能；成骨细胞

来源于骨髓间充质干细胞，是骨形成过程中的重要功能细胞，

其主要功能是分泌骨基质，不仅与骨的形成密切相关，且在

骨吸收过程中也起关键性作用；所述的成骨细胞对骨组织的

生长发育、骨代谢平衡、骨量维持和损伤修复起关键作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”

效应的测定方法，该方法应用体外细胞培养的方式，将肾小

球系膜细胞直接作用于成骨细胞，在细胞水平观察两者的内

在联系。所述的方法能鉴定肾小球系膜细胞直接作用于成骨

细胞的效应，为证实中医“肾主骨”的理论提供现代科学理

论依据。本发明还提供了建立所述方法的步骤及其用途。本

发明的用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测定方法，

是将源于实验幼鼠的成骨细胞，在含有实验大鼠肾小球系膜

细胞培养上清液的培养液中培养后，测定经培养的成骨细胞

的增值及碱性磷酸酶的浓度，在细胞水平分析所述成骨细胞

和肾小球系膜细胞的内在联系，鉴定“肾主骨”效应。本发

明的一个实施例中将取于幼鼠的成骨细胞分成两组，一组用

含有正常大鼠血清的培养液培养，另一组用含有大鼠肾的系

膜细胞培养后的培养液上清去培养；在培养的第一、第二、

第三、第五天检测成骨细胞的增值情况，以及在第三天检测

培养上清液的碱性磷酸酶浓度，了解成骨细胞的生长及功能

的变化；实验结果显示，用含有大鼠肾的系膜细胞培养后的

培养液上清培养的成骨细胞能促进成骨细胞的生长分化及

功能；表明所述的体外细胞培养的方法能为证实中医“肾主

骨”的理论提供直接简单明了的现代科学理论依据。具体而

言，本发明的用体外细胞培养方式鉴定“肾主骨”效应的测

定方法，其特征在于，其包括步骤(I)分离培养实验大鼠肾

小球系膜细胞，所得肾小球系膜细胞免疫组化法鉴定为抗结

蛋白抗体阳性、抗细胞角蛋白抗体阴性；(2)提取分离成骨

细胞，所得成骨细胞鉴定结果显示显微镜下见细胞贴壁生长

呈三角形、纺锤形和多角形等多种形态，培养35天，细胞

体积增大，见较多细胞分裂相；胞浆丰富，向外伸展，伸出

多个突起，与周围细胞的突起相互连结；培养I周左右，细

胞融合，多呈立方形；行碱性磷酸酶染色，倒置相差显微镜

下观察细胞的细胞核及细胞质上形成了灰黑至深黑色颗粒

状或片状沉淀；(3)分组培养成骨细胞，先用无血清培养液

培养24h，然后分为正常血清组和系膜细胞组，正常血清组

予含10%的正常大鼠血清RPMI-1640培养液；系膜细胞组予

含20%的系膜细胞上清液的正常大鼠血清RPMI-1640培养液；

(4)制备培养液；正常血清组培养液SD雄性大鼠常规取血，

离心，收集上清液，-20°C冷藏，使用前4°C解冻过夜，

56°C水浴灭活，过滤除菌，用RPMI-1640培养液稀释至

10%；系膜细胞组培养液取第3代系膜细胞接种培养瓶中，

每周3次换液至细胞铺占瓶底约80%，换用含10%的正常小

鼠血清RPMI-1640培养液，继续培养，取上清备用，使用时

用正常血清组培养液稀释至20%