质粒提取的原理.pdfVIP

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：

溶液I，50mM葡萄糖/25mMTris-Cl/10mMEDTA，pH8.0；

溶液II，0.2NNaOH/1%SDS；

溶液III，3M醋酸钾/2M醋酸。

让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的

pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。那么

50mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬

浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其

实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。

那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分

子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液

I中加入高达10mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离

子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是

在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质

粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒

呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一

点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

碱裂解法提取质粒DNA的原理及各溶液的作用

轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使

用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空

气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，

所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还

是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从

bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜

的0.4NNaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），

自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为

SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因

组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的

描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？

那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不

要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，

必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的

断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。

每个人都知道，溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这

沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样

怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量

沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，

也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。

既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶

液中慢慢加入5N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此

高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现

沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）遇到

钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS

是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离

子置换