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用以检测突变的方法与引物组的制作方法

用以检测突变的方法与引物组的制作方法

在此揭示以聚合酶链式反应(polymerase?chain?reaction，

简称PCR)为基础的方法，此方法可用以检测样本中目标基因

之一所选区域中是否发生插入/缺失变异(相较于一参考序

列)。目标基因具有一模板股与一编码链。此方法运用包含

一抑制引物以及一正向引物的引物组。所用的抑制引物与正

向引物部分序列重叠，但具有不同的解链温度，且抑制引物

的3’端经修饰而能够防止抑制引物在PCR过程中延伸。因

此，在特定的PCR条件下，能检测到PCR产物意味着在所选

区域中发生了插入/缺失突变，而未检测到PCR产物意味着

在所选区域中并未发生插入/缺失突变。

【专利说明】用以检测突变的方法与引物组

(1)

【技术领域】

[0001]本发明是关于用以检测变异的方法与引物组。具体

来说，本发明是关于插入和/或缺失变异的检测。

(2)

【背景技术】

[0002]基因突变(genemutat1n)系指一特定基因或调控序

列的核苷酸序列相较于天然(或正常)核苷酸序列有所改变。

突变可以是点突变(pointmutat1n;即，单一核苷酸置换)、

一或多个核苷酸的缺失(delet1n)或插入(insert1n)、多个

核苷酸的置换(substitut1n)或在染色体层级的互换

(crossing-over)。

[0003]近年来，用以检测点突变或染色体互换的技术发展

迅速。举例来说，可利用桑格式直接测序法(Sanger’s

directsequencing)来对目标序列测序，以得知发生突变的

一或多个核苷酸。然而此种直接测序的灵敏度不高，因而限

制了此技术在临床与研究领域等的应用。或者是可采用专一

的引物和/或探针，以正向检测目标序列上的点突变或互换。

然而，运用上述方法来检测插入突变与缺失突变的相关报导

并不多见。传统上，在设计用以检测插入/缺失突变的引物

或探针时，必须先知道突变部位的序列。当目标基因中带有

超过一个的插入和/或缺失核苷酸时，必须使用多个引物才

能确保所有突变序列都能被检测。此外，传统方法极易发生

检测错误，部分是因为以引物或探针和目标基因进行杂交

(hybridizat1n)时,突变部位可能形成环圈(loopedout),因

此引物或探针仍可和具有突变核苷酸之目标基因发生非特

异性的杂交(unspecifichybridizat1n)。更有甚者,这些习

知检测方法之检测灵敏度(detect1nsensitivity)通常较低，

因而需要使用大量的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,

简称DNA)和/或经过更多次的反应循环,使得整个反应耗时

费力。在某些情形中，必须使用实时定量聚合酶链式反应

(real-timequantitativepolymerasechainreact1n,简称

RTQ-PCR)和/或RTQ-PCR专用的设备才能够进行检测。因而，

为了确保得到正确的检测结果，习知方法可能需要花费较多

时间或成本来优化反应参数。以上种种因素限制了这些技术

在临床试验以及基础研究等领域的应用。

[0004]有鉴于上述问题，相关领亟需提出一种能够正确地

检测插入和/或缺失突变的方法。

(3)

【发明内容】

[0005]

【发明内容】

旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容

具备基本的理解。此

【发明内容】

并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实

施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

【发明内容】

旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容

具备基本的理解。此

【发明内容】

并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实

施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

[0006]本发明至少部分是基于一种新颖的引物设计方案，

此种设计方案使得样本中，带有变体序列(相较于参考序列)

的目标基因能够被扩增，且因而能够检测到此种具有突变的

目标基因。具体来说，所述目标基因具有模板链以及和此模

板链互补的编码链，而本发明提出的引物组及方法是针对该

模板链中一段选定区域来进行设计。此处所述的选定区域可

能带有或不带有至少一变异核苷酸，此变异核苷酸可能是被

插入到参考核苷酸序列中，或自参考核苷酸序列中被移除。

于一实施例中，参考序列可为野生型(正常)序列，此时变体

序列可带有插入和/或缺失突变