基因工程工具酶.pptx

基因工程工具酶基因工程工具酶第1页

2024/7/182基因工程中常见工具酶基因工程工具酶第2页

2024/7/183第二章基因工程工具酶第—节限制性核酸内切酶第二节DNA连接酶第三节DNA聚合酶第四节修饰酶第五节核酸酶基因工程工具酶第3页

2024/7/18第—节限制性核酸内切酶4第一节限制性核酸内切酶1、宿主限制和修饰现象2、限制性核酸内切酶类型3、限制性核酸内切酶命名4、Ⅱ型限制性核酸内切酶基础特征5、Ⅱ型限制性核酸内切酶酶切反应6、影响限制性核酸内切酶活性原因基因工程工具酶第4页

2024/7/1851、宿主限制和修饰现象E.ColiBE.ColiKλ(B)修饰λ(K)修饰（限制）10-4（限制）4×10-411基因工程工具酶第5页

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1、宿主限制和修饰现象

寄主细胞控制限制与修饰（R/M体系）宿主控制限制在大肠杆菌K菌株上生长λ噬体则表示为λ（K）。试验表明，用这种λ（K）噬菌体感染大肠杆菌B菌株，形成噬菌斑效率就很低，所以咱们说λ（K）噬菌体受到了B菌体限制。基因工程工具酶第6页

2024/7/187宿主控制修饰在这些稀有由λ（B）形成噬菌斑中噬菌群体，则已经发生了一些改变。用这些改变了λ（B）噬菌体再感染B菌株，它们就能够在B菌株上有效地生长。如此由第二个寄主菌株（大肠杆菌B株）赋予λ噬菌体这种非遗传化，使得它再感染时能够有效地生长，而没有再次受到限制现象，称之为修饰。不论是限制还是修饰，都是由寄主控制，咱们统称为寄主控制限制与修饰现象。基因工程工具酶第7页

2024/7/18第—节限制性核酸内切酶8?(B)?(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰Methylation基因组DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan从大肠杆菌K和B中发觉了I型限制性核酸内切酶；1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶HindII，使得DNA分子体外准确切割成为可能。限制—修饰酶学假说基因工程工具酶第8页

2024/7/1891.1限制（Restriction）宿主DNA中特定序列被甲基化，无法被本身限制酶切割分解，而无甲基化外源DNA将被宿主限制酶摧毀，即限制性内切酶将侵入细菌体内外源DNA切成小片断。基因工程工具酶第9页

2024/7/18101.2修饰（Modification）细菌本身DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被本身限制性内切酶识别切割①Dam甲基化酶②Dcm甲基化酶基因工程工具酶第10页

2024/7/18111.3限制与修饰现象意义几乎全部限制性内切酶都要和能识别而且甲基化相同DNA位点甲基化酶共同作用。这两个酶——限制性内切酶和甲基化酶一起称为限制—修饰系统(R-M系统)。在甲基化后，DNA位点被保护起来，所以宿主细胞中甲基化DNA能够不被限制性内切核酸酶消化。寄主控制限制与修饰是一个广泛过程，它存在有两方面作用。保护本身DNA不受限制破坏外源DNA使之快速降解基因工程工具酶第11页

2024/7/18第—节限制性核酸内切酶12第一节限制性核酸内切酶1、宿主限制和修饰现象2、限制性核酸内切酶类型3、限制性核酸内切酶命名4、Ⅱ型限制性核酸内切酶基础特征5、Ⅱ型限制性核酸内切酶酶切反应6、影响限制性核酸内切酶活性原因基因工程工具酶第12页

2024/7/18第—节限制性核酸内切酶132限制性核酸内切酶类型2.1限制性核酸内切酶概念限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）:是一类能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并能准确特异地切割双链DNA分子核酸内切酶。已经从近300中微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。年2月共发觉3773种限制性内切酶，I、II、III型各有68、3692、10种，甲基化指导3种,商品化609种,II型中共有223种特异性。基因工程工具酶第13页

2024/7/18第—节限制性核酸内切酶142.2限制性核酸内切酶分类2.2.1Ⅰ型限制性酶最早(1968)发觉一个复合功效酶，具修饰和切割DNA两种特征。该酶识别位点上两条DNA链均未甲基化，就行使内切酶功效，并在切割DNA同时或以后转变为ATP酶；假如位点上只有一条链被甲基化，则发挥修饰功效，使另一条链也甲基化；若位点两条链均已甲基化，就与位点解离。基因工程工具酶第14页

2024/7/1815它显著特点：是能识别DNA分子中特定核苷酸序列，但切割作用却是随机进行，普通在距离识别位点上千碱基对以外随机