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第三章胚胎干细胞分离培养

1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。

胚胎干细胞研究概况

ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。

近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎

重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系

[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。利用定向诱导分化技

术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。

国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。丛笑倩等[14]最早分离并建立了129-C3H小鼠ESCs系。随后，胡立新等[15]得到小鼠ESCs种系嵌合体。何志旭等[16]从人囊胚内细胞团分离培养并建立了3株人类ESCs系，在体外分别传代至40代、32代和30代，使我国跻身于该项研究先进行列，这是我国第1株能稳定传代的中国人类ESCs系。董雅娟等[17]由牛的体细胞克隆胚分离获得了类ESCs集落，为ESCs的获得提供了一种途径。

胚胎干细胞的体外培养

ESCs的分离培养过程，通常是将桑椹胚细胞、囊胚内细胞团或胎儿原始生殖细胞接种到培养体系中进行抑制分化培养，类ESCs增殖形成岛状或巢状集落后，挑选典型集落用消化液消化离散细胞，接种到新的培养体系中，反复传代，获得纯度高、能稳定传代并维持未分化状态和全能性的ESCs[20]。

胚胎干细胞的分离方法

以早期胚胎为材料首先要获得内细胞团(innercellmass，ICM)。由囊胚分离培养ESCs时要分离ICM通常有两种方法[18-19]：第一种方法是把获得的囊胚放于培养体系中培养，使其自然发育孵出并贴壁生长，形成清晰的细胞集落后将其挑选出来进行培养；第二种方法是免疫外科手术法，去除透明带后，通过抗原抗体反应使滋养层细胞肿胀松散，然后吹打将其去除[18-19]。将得到的ICM细胞培养在长有饲养层细胞的培养皿中。以原始生殖细胞(primordialgermcells，PGCs)为材料，可根据不同物种，采集胎儿的特定组织，可直接培养，也可经消化离心等过程制备含PGCs的悬浮液，再接种于新制备的饲养层上。待其充分增殖后，挑取、消化离散并接种于新的饲养层上，经反复筛选后即可获得ESCs。

胚胎干细胞的培养方法

ESCs的培养方法主要是有饲养层细胞培养法和无饲养层细胞培养法两种，后者又可分为LIF辅助培养法和条件培养基培养法[20]。几种方法各有利弊，使用较多的仍是有饲养层细胞培养法。

采用有饲养层细胞培养法需要先准备饲养层细胞。目前使用的饲养层细胞主要有原代小鼠胚胎成纤维细胞(primarymouseembryofibroblast，PMEF)、3代～5代小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryofibroblast，MEF)以及已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和

耐乌苯苷亚系(SIMmouseembryo-derivedthioguanineandouabainresistant，STO)细胞。将超排处理或未超排处理的雌鼠与雄鼠合笼，观察到有阴道栓的视为怀孕，并记为0.5d，于13