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聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白
聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白
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掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳原理;
学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳操作技术;
了解血清蛋白主要成份。
一、试验目标
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二、试验原理
不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中,蛋白样品经过浓缩胶浓缩按分子大小排列成层,然后进入分离胶,伴随电泳不停进行,不一样大小、电荷蛋白质分子逐步被分开。
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Bis将单体长链连成网状结构
TEMED催化AP生成硫酸自由基
1、聚丙烯酰胺凝胶生成
催化Acr聚合成长链
Acr:丙烯酰胺
Bis:甲叉双丙烯酰胺
AP:过硫酸胺(催化剂)
TEMED:N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(加速剂)
Acr、Bis决定孔径大小
AP、TEMED决定聚合速度
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连续胶电泳
采取相同孔径凝胶和相同缓冲系统(样品缓冲液、凝胶缓冲液
和电极缓冲液),在pH恒定、离子强度相同条件下进行。
优点:
制胶简单、快捷
缓冲液pH值恒定,能够预防样品进胶后因pH值改变发生凝聚和沉淀
缓冲系统组成简单,起源广泛
缺点:
分辨率不高
2、连续胶和不连续胶电泳
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不连续胶电泳
采取不相同孔径凝胶和不一样缓冲系统电泳方式,在电泳分离过程中,由
于浓缩胶堆积作用,可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带,然后
在一定浓度或浓度梯度凝胶上进行分离。
优点:
分辨率高
用于复杂和特殊样品分离
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不连续电泳三种物理效应
样品浓缩效应
凝胶分子筛效应
电荷效应
电泳过程三种效应同时存在,对蛋白样品起协同作用,使样品各组分按照带电量、分子质量及形状按一定次序分离。
不连续电泳四种不连续体系
凝胶不连续
缓冲液成份不连续
缓冲液pH值不连续
电压梯度不连续
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三、试验步骤
封槽
清洁、干燥小玻管一端,用Parafilm贴封后垂直放在管架上
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分离胶:A:C:D:E=1:2:3:2(V/V)
浓缩胶:B:C:D:E=2:1:5:2(V/V)
A:pH8.9Tris/Hcl缓冲液
B:pH6.7Tris/Hcl缓冲液
C:30%Acr-Bis贮存液
D:水
E:过硫酸铵灌装前加入TEMED,混匀
取洁净玻璃管,下端封口膜封好(主要);用注射器加分离胶至管口1-2cm处,封水(沿管壁,动作要慢);凝固后弃水、吸干;加浓缩胶距管口2-3mm处、封水;凝固后备用。
制胶和灌胶
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加样
用微量注射器取样品液15μl,针头伸入玻璃管上口,沿壁加在浓缩胶面上,迟缓注入。
电泳
连接电极,上负下正;
浓缩胶:3mA/管,分离胶:4mA/管;
待示踪染料靠近凝胶管底部约0.5cm处,切断电源。
剥胶
取下凝胶管,用注射器吸收一定量蒸馏水,将针头插入胶柱-与管内壁之间,边注水边旋转玻管,直至胶柱与管壁分离,然后用洗耳球轻轻在玻管一端加压,使凝胶柱从玻管迟缓滑出,将凝胶柱置于洁净试管内,用蒸馏水冲洗几次。
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染色
将凝胶柱置于0.05%氨基黑10B溶液中浸染20min,然后再浸入7%醋酸溶液中脱色。
血清蛋白在凝胶柱上可分出十多条色带。
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