目的基因的克隆与分离鉴定专家讲座.pptx

6目标基因克隆与分离判定;基因克隆与基因分离;2、基因克隆;基因工程或DNA重组技术前提条件是从生物

体基因组中分离克隆目标基因。;普通来说，目标基因克隆战略分为两大类：;第一节目标基因克隆;一、鸟枪法;(一)鸟枪法克隆目标基因基本战略;;1.染色体DNA切断;2.与载体连接;3.转化受体细胞;问题;(二)鸟枪法操作改进;比如，已知某目标基因位于1.8kb

SalI片段中，将染色体DNA用SalI

切开，琼脂糖凝胶电泳分离；;凝胶DNA片段回收技术;凝胶DNA片段回收程序;(三)鸟枪法克隆目标基因不足;二、cDNA法;(一)cDNA法克隆目标基因基本战略;2.cDNA第二链合成;DNApoldNTPs;dCTP;3.双链cDNA克隆;(二)cDNA法克隆目标基因不足;三PCR法;;由TaqDNA聚合酶扩增PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP含有优先聚合活性。因为该突出碱基存在，克隆时即能够采取TdT末端加同聚尾方法与载体拼接，也能够使用专门T载体克隆。;四化学合成法;一、化学合成DNA发展;三、化学合成DNA（寡核苷酸）应用;(一)化学合成法基本战略;2.补钉延长法：;3.大片段酶促法：;;化学合成单元操作;;全基因合成问题;第一节目标基因克隆;五、基因（组）文库构建;(一)基因文库基本概念;基因文库构建基本战略;1.重组克隆总数不宜过大，以减轻筛选工作压力；;基因文库完备性是指：在构建基因文库中任一基因存在概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间关系可用下式表示：;比如，人单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中

克隆片段平均大小为15kb,则构建一个完备性为0.9

基因文库最少需要45万个克隆；;（二）基因文库构建程序;2.基因组DNA切割;3.载体和受体选择;λ-DNA;4.基因文库构建技术性问题;第二节基因分离;一、基于基因功效基因分离技术;1、已知目标基因氨基酸序列（功效克隆）;;密集铺板（1-10万）;;依据近缘物种间或进化关系较近物种间功

能相关基因间核苷酸序列保守性，设计

探针，从基因文库中筛选并判定目标基因。;;A.cDNA合成;B.同源片段克隆;Gene1:;简并PCR扩增同源片段;C.cDNA3末端序列克隆;巢式PCR扩增3-端cDNA;图ZmABC1-10基因全长cDNA克隆;D.cDNA5末端序列克隆;1）TaKaRa企业RACE原理;2）Clontech企业SMART5-RACE原理;③然后用一个含有部分接头序列通用引物UPM（UniversalPrimer）作为上游引物，用一个基因特异引物（GeneSpecificPrimer，GSP）作为下游引物，PCR扩增目标基因5′末端cDNA片段;3）InvitrogenGeneRACER5-RACE原理;CIP;②去帽反应：

利用烟草焦磷酸酶TobaccoAcidPyrophosphatase（TAP）消化掉mRNA5末端帽子结构；;③接头连接：

将经去磷酸化和去帽处理RNA转入另一PCR管中，加入RNA接头片段，在RNALigase作用下，将RNAOligo接头连接于去帽mRNA5末端；;④反转录：

在反转录酶作用下，利用Oligo(dT)反转录取得cDNA;;;⑥巢式PCR扩增全长cDNA：

依据已取得目标基因3‘序列和5’序列，设计基因特异巢式引物5‘GSP和3’GSP，巢式PCR扩增cDNA全长序列。;

差异杂交Differentialhybridization

扣除杂交Substractivehybridization

抑制性消减杂交Suppressionsubstractivehybrid

差异显示Differentialdisplay

基因芯片技术Genechips;差异杂交(Differentialhybridization)又叫差异筛选

(Differentialscreening)，适合用于分离经特殊处理而被

诱发表示mRNA之cDNA克隆。;1）差异杂交操作程序;2）差异杂交不足;不表示目标基因

总mRNA;差异分离程序;;3.3抑制性消减杂交(SuppressionSubtractiveHybridization,SSH);;;;总mRNA

（B）;;基因芯片(genechip);激光共聚焦荧光扫描显微镜检测杂交信号;二、基于DNA插入作用基因分离技术;利用转座子转座作用使被插入目标基因突变

失去活性，而转座子删除作用又可使目标基因

复活。;;根癌农杆菌中Ti质粒