肿瘤细胞培养专家讲座.pptx

肿瘤细胞培养;内容纲要;一、肿瘤细胞体外培养主要性和应用;1、肿瘤病因和发病机制研究;2、抗癌药品筛选方面研究;3、癌基因和抑癌基因方面研究;4、癌细胞诱导分化和逆转方面研究;5、癌细胞杀伤效应研究;二、体外培养肿瘤细胞特征;培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数镜下观察比二倍体细胞清楚，核膜、核仁轮廓显著，核浆百分比大。

电镜观察癌细胞表面微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则。;2、生长增殖（不受控增殖性）;3、永生性;4、致瘤性;5、浸润性;6、异质性;;7、细胞遗传;;三、肿瘤细胞系建立;恶性转化细胞系和癌细胞系一样含有永生性和恶性表型，对此两种起源细胞系判定也是相同，为研究恶性肿瘤提供了有用模型。

普通转化细胞系只含有没有限生长能力，不含有恶性细胞表型，此种细胞系可相同于正常细胞模型而被应用。;癌细胞培养最主要问题是从体内到体外环境改变。

培养中发觉，有些肿瘤在体内生长，但在体外却难以生长。;①依赖性：

肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长活性。;②肿瘤细胞自分泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长需求，降低肿瘤细胞生长增殖力。

③并非全部肿瘤细胞都有强生长活力和长生命周期，只有干细胞才有强增殖生长能力，但这些细胞数量极少。

④离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相同特殊生存条件。;（一）癌细胞原代培养;1、取材;取材后尽快将癌组织进行培养，普通4小时内细胞存活最好。标本在4℃存放，不宜超出24小时。;人癌细胞建系必须要有完整统计，包含组织起源、病人姓名、住院号、年纪、性别、临床诊疗、病理诊疗（应明确分类分期）、术前放化疗情况，为细胞建系主要材料。

为了判定建立细胞系起源和生物学特征，最好留有病人正常组织和血标本。;2、分离;胰蛋白酶是分离细胞最常应用酶，但它对结缔组织消化能力有限，适合含结缔组织较少肿瘤，而且对??胞膜有损害作用，影响细胞存活。

胶原蛋白酶仅对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大，适于分离纤维性组织、上皮及癌组织。;;注意：

当肿瘤组织标本很小，不能用酶消化获取癌细胞时，能够用组织块法进行原代培养。

癌组织中不可防止有已耗竭和坏死细胞，在酶消化前，应尽可能去除，以免接种后很快溶解破坏，释放出影响癌细胞生长有害物。;3、接种细胞;4、成纤维细胞过分生长去除;将玻璃吸管前端在火焰上烧弯曲，用作除去成纤维细胞工具。可在显微镜下直接刮除生长成纤维细胞，也可事先在显微镜下对有成纤维细胞生长单层培养瓶上做出标识，然后按标识刮除。刮除后，用培养液洗1~2次后，加入新培养液培养。如需要可屡次刮除。;依据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢特点，并结合使用不加血清营养液，把含有两类细胞细胞悬液重复贴壁，使两类细胞相互分离。;;（3）消化排除法;（4）胶原酶消化法;（5）其它方法;5、选择性培养基;HITES选择培养基是一个改良RPMI-1640培养基，含有氢化可松、胰岛素、转铁蛋白、雌激素、硒等成份。HITES培养基适适用于人小细胞肺癌建系。;;6、喂养层;（二）癌细胞原代培养换液和传代;2、传代;;3、冻存和复苏;（三）癌细胞系建立注意事项;转化细胞系建立;转化表型改变主要有3类：;致瘤性是判断恶性转化或普通转化细胞系最主要指标。;（一）诱变转化细胞方法;化学致突变剂：惯用甲基硝基亚硝基胍（N-methy-N-nitro-Nnitrosoguanidine，MNNG）；

物理方法：射线照射；

病毒转化：用EB病毒感染淋巴细胞引发转化，SV40病毒转化正常细胞成为恶性细胞；

用外源基因转染细胞，诱发细胞转化，包含癌基因如ras、mye，病毒基因如SV40LT抗原基因和端粒酶基因等。;（二）外源基因转化细胞;选择适当转基因方法：化学方法最惯用磷酸钙、脂质体、基因枪、电转移等。

选择适当转染细胞，易培养和传代，无自发转化能力。

用转基因方法转染细胞获阳性集落。

证实外源基因有没有表示。

证实转染细胞表型是否改变和有没有致瘤性。;1、SV40LT抗原基因转化人成纤维细胞;2、转染端粒酶基因;SV40诱导不死性细胞，伴有细胞不正常分化和核型不稳定，表现出对动物一定程度致瘤性。而端粒酶转染细胞极少有核型改变和上皮细胞分化特点，保持更多正常细胞表型。说明SV40LT多引发细胞恶性转化，而端粒酶基因主要诱导细胞取得不死性。;3、转基因小鼠;（三）EB病毒感染B细胞;（四）转化细胞系建立注意事项;四、癌细胞系和转化细胞系判定;1、光镜直接检