一代、二代、三代基因测序技术的发展历史及应用.pptxVIP

一代、二代、三代基因测序技术

的发展历史及应用;目录

CONTENT;基因测序技术也称作DNA测序技术，即获得目的DNA片段碱基排列顺序的技术，获得目的DNA片段的序列是进一步进行分子生物学研究和基因改造的基础。;1977年，WalterGilbert和FrederickSanger发明了第一台基因测序仪，并应用其测定了第一个基因组序列，噬菌体X174，全长5375个碱基。WalterGilbert和FrederickSanger也因在测序技术中的贡献获得了1980年诺贝尔化学奖。

Sanger所发明的测序方法被称为第一代测序技术，该技术直到现在依然被广泛使用，但是其一次只能获得一条长度在700～1000个碱基的序列，无法满足现代科学发展对生物基因序列获取的迫切需求。;毛细管电泳技术的原理;完整的测序过程分为4步：

1.DNA变性，形成单链；

2.DNA聚合酶结合；

3.dNTP中混有低比例的ddNTP，得到不同位置终止的序列；

4.凝胶电泳获得序列：对得到的序列进行凝胶电泳，得到一张色谱图，根据碱基的顺序和位置确定序列信息。;BigDye直接循环测序试剂盒的测序步骤更少，操作时间更短,将PCR清洗和循环测序结合到一个步骤中，时间缩短40%。;仪器名称;第一代测序技术的应用：

PCR产物测序：对目的基因的PCR产物进行测序，得到目的基因序列；（如科研机构克隆拟南芥的某个基因）

重测序：突变、SNPs、插入或缺失克隆产物的验证；（如重组质粒的验证）

分型分析：微生物和真菌分类学鉴定、HLA分型、病毒分型等；（如某一株细菌的种属鉴定，扩增出16S）

临床应用：肿瘤突变基因的检测和肿瘤个体化治疗，致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传病检测；（如非小细胞肺癌EGFR检测、脆性X综合征的检测、天昊流产物无非整倍体检测、STR亲子鉴定）

对新一代测序技术的结果进行验证。;目录

CONTENT;二代测序;二代测序的技术平台——Roche/454;二代测序的技术平台——Roche/454;二代测序的技术平台——Roche/454;二代测序的技术平台——ThermoFisher

;二代测序的技术平台——ThermoFisher;二代测序的技术平台——ThermoFisher;二代测序的技术平台——ThermoFisher;二代测序的技术平台——ThermoFisher;二代测序的技术平台——Illumina/Solexa;靶向测序的建库策略:杂交捕获vs扩增子测序;二代测序的技术平台——Illumina/Solexa;二代测序的技术平台——Illumina/Solexa;二代测序的技术平台——华大智造;二代测序的技术平台——华大智造;二代测序的技术平台——华大智造;二代测序的技术平台——华大智造;二代测序技术的应用;目录

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2008年Helicos公司推出第一台单分子测序仪HeliScope，不过它的读长很短，只有30-50个碱基，尽管是单分子测序，但并没有形成市场影响力。

2011年，Pacbio公司推出了第一台RS单分子测序仪，不过Pacbio刚上市时虽然改善了读长，但是错误率很高，大约15%，主要是在早期没有成熟的算法、软件和数据库去矫正数据，所以很难真正去应用。2012年开发出新的算法，可以用二代测序数据去矫正三代测序的数据，后来又开发出可以用三代测序的数据去矫正三代测序，才把长序列变的比较准确。2019年Pacbio推出了Sequal系列测序仪，目前读长可以长达20kb。

2014年牛津纳米孔测序技术公司ONT推出了第一个纳米孔测序仪MinlON。读长超长，通量超大，产品最小可以做到U盘大小，特别适合在特殊环境下进行快速测序。

;三代测序--PacBio平台测序原理;—SMRTCell：包含成千上万个ZMW小孔的芯片，同时对大量单分子DNA测序。

—PacBioRSII仪器配套的Cell含有15万个ZMW小孔，通量为0.5~1Gb；

—PacBioSequel仪器配套的Cell含有100万个ZMW小孔，通量为5~10Gb；;三代测序--PacBio平台测序原理;注：经过改良的DNA聚合酶每秒合成3个碱基，确保光学系统能够捕捉到相应碱基释放的荧光信号;SequelII平台可提供CLRLibrary和CCSlibrary（HIFI）两种测序模式;Reader——跨膜蛋白，可以嵌入到细胞膜中作为离子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白纳米孔。经过基因改造得到Reader。

Membrane——多聚物薄膜，Reader蛋白会被嵌入到高电阻率的由人工合成的多聚物膜中，膜两侧是离子溶液，在两侧加不同的电位，离子就会在孔中流动，形成电流。

Motor——