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示踪法自体骨髓干细胞移植实验研究

目的:研究大鼠骨髓干细胞移植后的定位与分化状态。方法:以荧光染料DiI

为示踪剂对移植的骨髓干细胞进行标记,并通过门静脉移植入大鼠肝脏,分别于

7、14、21、28d采集移植鼠的肝组织进行荧光检测。结果:荧光剂DiI标记的干

细胞在移植鼠肝组织中定位,并且分化增殖。其亮红色荧光随时间的推移略有减

弱,但并不消失。结论:DiI荧光剂为可靠的干细胞示踪剂,可应用于移植细胞的标

记,骨髓干细胞可在受损肝组织中定位并分化增殖。

[Abstract]Objective:Toresearchthelocationanddifferentiationofratsbone

marrowstemcellsaftertransplantation.Methods:Labeledratsbonemarrowstem

vein,collectedanddetectedthehepatictissuesfromthetransplantationratsafter

7,14,21,28daysrespectively.Results:ThestemcellslabeledbyfluorochromeDiI

fluorescencedeclinedovertime,butitdidn’tdisappear.Conclusion:DiIisareliable

locatedproliferatedanddifferentiatedindamagedhepatictissue.

[Keywords]Tracermethod;Bonemarrowcells;Transplant;Experimental

research

目前,骨髓干细胞移植作为一种新的治疗手段,在各系统疾病中有被广泛应用

的趋势,但其效果也只能从各项生化、生理指标的变化来判定,很难做到直观判别

移植的干细胞是否定位于靶位,分化与增殖而发挥作用。为探求了解移植干细胞

在病变部位的状态,笔者用荧光剂DiI作为示踪剂对移植的骨髓干细胞进行标记、

检测分析,现将结果报道如下:

1材料与方法

1.1实验动物

雄性SD大鼠10只,体重(200±20)g,清洁级,购自哈尔滨兽医研究所动物室。

1.2试剂与仪器

D-氨基半乳糖购自重庆医科大学试剂中心,亚硫酸钠、内毒素、DiI购自Sigma

公司,淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物有限公司,rhG-CSF为山东齐鲁制药有限

公司生产,荧光显微镜为德国莱卡480型,温控离心机为美国贝克曼产品。

1.3实验方法

1.3.1动物模型制备与干细胞标记10%D-氨基半乳糖溶液(以0.9%NaCl溶液

配制,以0.1mol/LNaOH调PH至7.4)按10mg/kg体重,内毒素20μg/kg体重一次

性对模型鼠进行腹腔注射制备大鼠肝衰竭模型。对照组以0.9%NaCl溶液用同样

方法制备。诱导肝衰竭后正常饮食,并于次日起以10μg/kg体重rhG-CSF对模型

鼠行皮下注射,每天1次,共计4次,于第5天从模型鼠舌下以肝素抗凝采血1ml,

给予混后的等量磷酸盐缓冲液(PBS)混匀,轻轻叠于1.083Ficoll-Hypaque上(比例

为3∶2),25℃2000r/min离心20min,吸出单个核细胞层,加入2ml

PBS(PH7.4,0.01mol/L)中洗涤3次,每次以1500r/min离心5min,弃上清后取少量

细胞进行曲利苯兰活性率检测,确定细胞活率。再以1mlPBS对细胞进行悬浮混

匀。在悬浮细胞中加入以无水乙醇配制的(浓度为1mmol/L)CM-DiI荧光剂5ml,

混匀后避光放入37℃水溶液20min进行标记,再以PBS洗涤3次,每次以2000

r/min离心10min,弃上清,在荧光镜550nm光片下判读标记率,并调细胞数为

1.0×108/ml,吸出0.2ml标记好的干细胞悬液放暗盒37℃5%CO2培养箱中待用。

1.3.2标记干细胞的移植以3%戊巴比妥钠按25mg/kg对采血后的模型鼠进

行腹腔注射,麻醉后固定于操作台,以0.8%亚硫酸钠对大鼠上腹部进行脱毛处理,

再以75%乙醇,碘酒大面积消毒铺孔中,在无菌条件下于大鼠上腹部