荧光量PCR技术专题专家讲座.pptx

TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD;内容概要;实时定量PCR技术：

利用荧光信号改变实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量改变，经过Ct值和标准曲线关系对起始模板进行定量分析;扩增曲线

荧光阈值

Ct值;Cycle（循环数）;Cycle（循环数）;Ct值定义：

PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号到达设定阈值时所经过扩增循环次数;横轴：PCR反应循环数;理想PCR反应;非理想PCR反应;在扩增产物到达荧光阈值时;Cyclenumber;线性关系、扩增效率确认;内容概要;非特异性荧光标识

SYBRGreenI

特异性荧光标识

TaqManProbe

;;热变性;问题点：

SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光，所以如

果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体产生，也将

同时被检测，从而可能造成检测结果不准确。

;将温度与荧光强度改变求导(-dI/dT);融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光

定量准确;使用方便，无须设计复杂

探针

含有价格优势;Taqman探针法——原理;;1、引物、探针设计：

探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，

引物尽可能靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃

2、反应参数确实定：

普通为：94℃，10-20S

60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高），也可经过温度梯度优化退火温度

3、优化引物和探针浓度：取得最小Ct值，最大信号/背景比值

引物浓度：100-900nM

探针浓度：50-300nM

4、其它与常规PCR相同;高度特异性

重复性好

灵敏度高

可进行多重定量;标识荧光发夹探针

环与目标序列互补

茎由互补配对序列组成;;高特异性：对目标序列

检测SNP最灵敏试剂之一

荧光背景低;几个方法应用比较;;内容概要;绝对定量解析方法;;一个目标基因——即需要确定其量值核酸序列。

一组标准样本——用来生成标准曲线。能够是含有目标基因质粒、PCR产物、基因组DNA等。

重复反应孔–——提议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。

标识方法选择——SYBRGreen法或探针法均可。

试验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。

;???粒标准品制备;;

方法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测

试剂：TIANGEN企业探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203）

标准品：质粒标准品浓度为106、105、104、103；2个重复；设阴性空白对照

试验步骤：提取HBVDNA；

设计特异引物；

设计TaqMan探针并标识探针；

荧光定量扩增；

结果分析：获取血液样品中HBVDNA准确copy数。;Sample;扩增效率（E）计算

E=10-1/斜率－1

=10-1/-3.29－1

=2.01－1

=1.01;未知样品拷贝数计算;相对定量解析方法;;相对定量分析方法;一个参考样本

一个或一个以上未知样本

一个目标基因

管家基因——用来校对不一样本之间目标基因实际表示量

重复反应孔–——提议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。

标识方法选择——SYBRGreen法或探针法均可。

试验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要）。

一组标准样本（有些分析方法不需要）;管家基因

维持细胞基本代谢活动所必须基因,

如：GAPDH、Actin、18SrRNA等;双标准曲线法

2-△△Ct法

;经过标准曲线对对照样品、待测样品目标基因及管家基因进行定量，然后依据计算公式求得相