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TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD;内容概要;实时定量PCR技术:
利用荧光信号改变实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量改变,经过Ct值和标准曲线关系对起始模板进行定量分析;扩增曲线
荧光阈值
Ct值;Cycle(循环数);Cycle(循环数);Ct值定义:
PCR扩增过程中,扩增产物荧光信号到达设定阈值时所经过扩增循环次数;横轴:PCR反应循环数;理想PCR反应;非理想PCR反应;在扩增产物到达荧光阈值时;Cyclenumber;线性关系、扩增效率确认;内容概要;非特异性荧光标识
SYBRGreenI
特异性荧光标识
TaqManProbe
;;热变性;问题点:
SYBRGreenI与双链DNA进行结合后散发荧光,所以如
果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体产生,也将
同时被检测,从而可能造成检测结果不准确。
;将温度与荧光强度改变求导(-dI/dT);融解曲线分析,单一峰无非特异性荧光
定量准确;使用方便,无须设计复杂
探针
含有价格优势;Taqman探针法——原理;;1、引物、探针设计:
探针Tm为68-70℃,30bp,5’不能有G,G可能会淬灭荧光素,
引物尽可能靠近探针,扩增片段400bp,引物Tm为59-60℃
2、反应参数确实定:
普通为:94℃,10-20S
60℃,30-60S(Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高),也可经过温度梯度优化退火温度
3、优化引物和探针浓度:取得最小Ct值,最大信号/背景比值
引物浓度:100-900nM
探针浓度:50-300nM
4、其它与常规PCR相同;高度特异性
重复性好
灵敏度高
可进行多重定量;标识荧光发夹探针
环与目标序列互补
茎由互补配对序列组成;;高特异性:对目标序列
检测SNP最灵敏试剂之一
荧光背景低;几个方法应用比较;;内容概要;绝对定量解析方法;;一个目标基因——即需要确定其量值核酸序列。
一组标准样本——用来生成标准曲线。能够是含有目标基因质粒、PCR产物、基因组DNA等。
重复反应孔–——提议每个样本使用三个或更多重复反应,以确保统计显著性。
标识方法选择——SYBRGreen法或探针法均可。
试验结果显示——扩增曲线;标准曲线;融解曲线(探针法不需要)。
;???粒标准品制备;;
方法:从血液中提取病毒DNA,以TaqMan探针法进行荧光定量检测
试剂:TIANGEN企业探针法试剂RealMasterMix(Probe)(目录号:FP203)
标准品:质粒标准品浓度为106、105、104、103;2个重复;设阴性空白对照
试验步骤:提取HBVDNA;
设计特异引物;
设计TaqMan探针并标识探针;
荧光定量扩增;
结果分析:获取血液样品中HBVDNA准确copy数。;Sample;扩增效率(E)计算
E=10-1/斜率-1
=10-1/-3.29-1
=2.01-1
=1.01;未知样品拷贝数计算;相对定量解析方法;;相对定量分析方法;一个参考样本
一个或一个以上未知样本
一个目标基因
管家基因——用来校对不一样本之间目标基因实际表示量
重复反应孔–——提议每个样本使用三个或更多重复反应,以确保统计显著性。
标识方法选择——SYBRGreen法或探针法均可。
试验结果显示——扩增曲线;标准曲线(有些分析方法不需要);融解曲线(探针法不需要)。
一组标准样本(有些分析方法不需要);管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须基因,
如:GAPDH、Actin、18SrRNA等;双标准曲线法
2-△△Ct法
;经过标准曲线对对照样品、待测样品目标基因及管家基因进行定量,然后依据计算公式求得相
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