多聚酶链式反应扩增DNA片段课件.pptVIP

温故知新1:组成DNA分子的基本单位是什么?这些基本单位是如何连接成DNA分子的?DNA分子结构有什么特点？

脱氧磷酸脱氧核糖核苷腺嘌呤（A）嘌呤脱氧核苷鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）酸含氮碱基嘧啶

32

OHPO5碱基OHO412O3OHOH碱基OOHOPOOH

5’碱基OHP碱基OHOO脱氧核糖O磷酸基团碱基磷酸二酯键O碱基O脱氧核糖HOOPOOH碱基脱氧核糖脱氧核苷酸链结构简图3’

3’5’3’

温故知新2DNA分子的复制过程是怎样的？DNA分子的复制需要哪些条件？

DNA复制的条件DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(一小段RNA)

一、基础知识（一）PCR原理：1、PCR（多聚酶链式反应）技术：是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。2、原理：利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。

3、PCR反应的条件DNA母链：提供复制的模板解旋酶：打开DNA双链80—100℃：4种脱氧核苷酸：合成子链的原料DNA聚合酶：催化合成DNA子链耐热的DNA聚合酶：ATP：为复制过程提供能量引物：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸((一一小般段是R一NA小)段单链DNA)缓冲溶液：维持反应的pH值不变

(二)PCR反应的过程1、变性：温度上升到90℃以上时,双链DNA解聚成为单链。2、复性（退火）：温度下降到50℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。3、延伸：温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在TaqDNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对的原则合成新的DNA链。

PCR循环第一步：加热变性:双链DNA解聚成为单链

PCR循环第二步：引物与模板序列复性（退火）:引物与模板DNA单链的互补序列配对结合

PCR循环第三步：引物延伸:合成新的DNA链

第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列

30次循环后扩增的数量循环次数DNA数量123248201,048,576301,073,741,824

4、PCR循环的结果①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸。②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。

第一轮结果第二轮结二、实验操作（一）设备及用具1、PCR仪实质上一台能够自动调控温度的仪器。2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml。3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次。

PCR仪

微量离心管微量移液器

（二）实验操作步骤1、准备按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上2、移液用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂

3、混合①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。②注意：A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。

4、离心①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。②离心目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。5、反应将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。

循环数变性复性延伸－预变性94℃，5min－30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min

6、注意事项PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头,一次性吸液枪头用一次更换一次。

三、课题成果评价（一）理论上DNA扩增数目的计算1、一条DNA，复制n次，DNA为：2n2、a条DNA，复制n次，DNA为：a2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。

2、过程①稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。③计算取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。

④计算DNA含量（?g）＝50x（260nm的读数）x稀释倍数公式中50的含义：