核酸测定波长含义.docx

1. A260nm

核酸测定各波长具体含义及相关问题

是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。DNA样品的A260吸光度值是否0.1。（请注意，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值0.1）

2.A280nm,A270nm

是蛋白最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5相当于50％蛋白质/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。

A230nm

是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA和RNA的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。

A320nm或A340nm

为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。纯样品的A320一般是0。

5.A260/A280和A260/A230

是核酸纯度的指示值。纯度好的DNA或RNA，在pH7-8.5下A260/A280的比值应该在2.0或2.5。纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。

当0.5％BSA蛋白质污染时，蛋白污染会导致260和280的数值都下降，其净结果是260/280比值下降，但260/280的比值变化并不显著，正如分子克隆3所说。但蛋白残留会导致230的数值显著上升，显著影响260/230的比值。也就是说，如果RNA样品的260/280＝1.7，260/230＝0.5，那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留，而是蛋白残留.

酚的最大吸收峰在270。酚的残留会显著的增加230、260和280的数值，同时酚的吸收峰与核酸的吸收峰合并后，最大吸收峰向270方向偏移，也就是说最大吸收峰在270附近。也就是说，如果RNA样品的260/280=1~1.5,260/230=1~1.5，那么污染原因就应该考虑是酚残留。

胍盐对RNA样品吸收有显著影响，会在小于230nm处产生大的吸收峰。胍盐残留不会影响260和280的数值，对260/280的比值不会造成大的影响，当然也不影响RNA定量。但胍盐残留对260/230比值具有明显影响。例如本例中260/230的比值小于0.21时，260/280的比值还2。也就是说，如果RNA样品的260/280=2，260/2301，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。

其他：

用分光光度计测量RNA时，用水而不是用TE缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。原因是低离子强度和低pH溶液会增加280nm处的光吸收值。

加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多，那样就很容易被蛋白污染，所以现在一般取400ul左右。当260/2301时，只有两种情况。一是胍盐污染，二是蛋白污染。