NYT 2257-2012 芒果细菌性黑斑病原菌分子检测技术规范.docx

ICS65.020

B16

中华人民共和国农业行业标准

NY/T2257—2012

芒果细菌性黑斑病原菌分子检测技术规范

Moleculardetectionforpathogenofmangobacterialblackspotdisease

2012-12-07发布2013-03-01实施

中华人民共和国农业部发布

I

NY/T2257--2012

前言

本标准按照GB/T1.1给出的规则起草。本标准由农业部农垦局提出。

本标准由农业部热带作物及制品标准化委员会归口。

本标准起草单位：中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。

本标准主要起草人：蒲金基、漆艳香、谢艺贤、张欣、张贺、陆英、张辉强。

NY/T2257—2012

芒果细菌性黑斑病原菌分子检测技术规范

1范围

本标准规定了芒果细菌性黑斑病原菌[Xanthomonascampestrispv.mangiferaeindicae(Patel,MonizKulkami)Robbs,Ribeiro.Kimura]分子检测方法。

本标准适用于芒果树叶片、枝条、果柄和里安细萌性黑斑病原菌的定性检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件不可少聊B坦期的引注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引其最本(包插所有的修改单)用于

SN/T1193基检测夹验室

3术语和定义

下列术语和适K

3.1

芒果细菌

又称芒

pv.mangife

疫性细菌病

A.8。

3.2

致病性基

HrpB基

及抗病植物产

斑病菌性

病害

敏性反

3.3

聚合酶链式elyme模板基因序列好高遢变

计的两条引物分别与DNA

酶的作用下以四种脱氧和核酸(dN

一循环，使欲扩增的基因片几何倍数建

短的

工物的致

scampestris

害芒果的检

A.6、A.7和

和诱导非寄主

on

I聚合酶作用和适宜的反应,根据模板序列设

应的一段而互加合，接着在DNA聚合

底物使物得以延伸，然后不魔复变性、退火和延伸这

4原理

根据芒果细菌性黑斑病原菌过敏性反应和致病在基囚HrpB序列特有碱基信息设计特异性引物，对待检样品进行PCR扩增。依据是否扩增获得预期321bp的DNA片段，判断样品中是否携带芒果细菌性黑斑病原菌。

5仪器设备及试剂

见B.1、B.2。

6取样

按附录A描述的症状仔细检查芒果树叶片、枝条、果柄和果实，发现芒果细菌性黑斑病疑似症状，

2

NY/T2257—2012

即取叶片、枝条、果柄或果实200g以上，装入牛皮纸袋中，送实验室检测。

7PCR检测

7.1PCR反应模板制备

见B.4.1。

7.2PCR反应

在PCR薄壁管中分别加入以下试剂(25μL体系)后进行PCR反应：1μL基因组DNA,10×PCR缓冲液(Mg2+Plus)2.5μL,脱氧核糖核苷酸(dNTP)混合物2μL,特异性引物(见表1)各0.5μL,Taq酶0.2μL,灭菌超纯水18.3μL。

表1PCR反应的引物序列及扩增产物

引物名称

引物序列

预期扩增产物

XcmHF

5-GGTGGTCGAACTCGTCGGCAT-3

321bp

XcmHR

5-GCCTGCGCCTGGATCGGTAT-3

反应条件：95℃预变性3min,后30个循环为95℃变性30s至60s;58℃退火45s至60s;72℃延伸1min;最后72℃延伸5min。取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存，存放时间不超过24h。

7.3反应体系中对照的设置

7.3.1阳性对照

用芒果细菌性黑斑病原菌基因组DNA作为模板。

7.3.2样品对照

用健康芒果种胚组织提取的基因组DNA作为模板。

7.3.3PCR反应体系对照

用配制反应体系的无菌超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染。

7.4PCR产物凝胶电泳检测

7.4.1凝胶制备

见B.4.2。

7.4.2加样与电泳

见B.4.3。

7.5凝胶成像分析

将整块琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪系统观察窗内，根据DNA分子量标准估计扩增条带的大小，并拍照保存，参见图1。

7.6防污染措施

检测过程