第十二章-基因敲除和RNA干涉.pptVIP

第十二章基因敲除和RNA干涉内容第一节基因敲除基因敲除（geneknock-out）又称基因打靶,通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基因改造,具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。二、基因敲除技术定义:通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。1.应用DNA同源重组原理进行基因敲除。2.利用随机插入突变进行基因敲除3.RNA干扰也可以引起基因敲除基因敲除技术与诺贝尔奖医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖,他们是美国盐湖城犹他州大学的MarieCapecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliversmithies教授以及英国加蒂夫大学的MartinEvans教授摘自《中华医学信息》2007年第22卷第21期基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）两种。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性,条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。一、实现基因敲除的多种原理和方法1利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初,胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年,首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年,Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在,运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

步骤基因载体的构建ES细胞的获得同源重组选择筛选已击中的细胞表型研究得到纯合体1.条件性基因敲除法条件性基因敲除法可定义为将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法噬菌体的Cre/Loxp系统、酵母细胞的FLP/FRT系统,尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。2.4诱导性基因敲除法诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点几种诱导性类型如下:四环素诱导型(图4)；干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型①诱导基因突变的时间可人为控制；

②可避免因基因突变而致死胎的问题

③在2个loxP位点之间的重组率较高；

④如用病毒或配体／DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达,则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。二、随机插入突变进行基因敲除细胞基因组中进行随机插入突变,建立一个携带随机插入突变的细胞库,然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞逆转率病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲除基因捕获法最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的新型方法neo基因插入到ES细胞染色体组中,并利用捕获基因的转录调控元件实现表达中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得基因捕获法的优缺点建立一个携带随机插入突变的ES细胞库节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析