小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定.pdfVIP

小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载

体的构建和鉴定

一、本文概述

本文旨在探讨小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载

体的构建与鉴定。我们将详细介绍Zhangfei基因在小鼠体内的功能

和作用，以及其在生物学研究中的重要性。接着，我们将阐述过表达

和shRNA干扰技术在基因功能研究中的应用，并解释为何选择慢病毒

载体作为本研究的工具。

在构建过表达慢病毒载体方面，我们将采用基因克隆技术将小鼠

Zhangfei基因插入慢病毒载体，以实现目的基因的高效表达。同时，

我们将对构建的过表达载体进行严格的鉴定，包括PCR、测序和

WesternBlot等方法，以确保载体的正确性和有效性。

在构建shRNA干扰慢病毒载体方面，我们将设计并合成针对小鼠

Zhangfei基因的特异性shRNA序列，并将其插入慢病毒载体以干扰

Zhangfei基因的表达。我们将对构建的shRNA干扰载体进行同样的

鉴定步骤，包括PCR、测序和WesternBlot等方法，以确保载体的

正确性和有效性。

我们将对构建的过表达和shRNA干扰慢病毒载体进行功能验证，

以评估其在小鼠体内对Zhangfei基因表达的调控效果。本研究的成

果将为进一步揭示Zhangfei基因的功能和机制提供有力的工具，并

为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。

二、材料与方法

2载体：慢病毒载体pLV-IRES-Puro和pLV-shRNA2购自Clontech

公司。

3酶和试剂：限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNAMarker、PCR

引物、PCR试剂等购自TaKaRa公司；胎牛血清（FBS）和DMEM培养

基购自Gibco公司；脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；RNA提

取试剂盒和逆转录试剂盒购自ThermoFisherScientific公司；小

鼠Zhangfei基因的cDNA序列通过PCR从小鼠cDNA文库中扩增得到。

4仪器：PCR仪、凝胶电泳仪、超净工作台、离心机、细胞培养

箱、荧光显微镜、倒置显微镜等。

（1）PCR扩增：以小鼠cDNA文库为模板，利用特异性引物扩增

Zhangfei基因的cDNA序列，并在上下游引物中分别引入合适的酶切

位点。

（2）酶切与连接：将PCR产物和慢病毒载体pLV-IRES-Puro分

别用相应的限制性内切酶进行双酶切，回收目的片段和载体片段，用

T4DNA连接酶连接。

（3）转化与筛选：将连接产物转化至DH5α大肠杆菌感受态细

胞中，挑选阳性克隆进行测序验证。

（1）设计并合成shRNA序列：根据Zhangfei基因的mRNA序列，

设计并合成特异性shRNA序列，将其插入到pLV-shRNA2载体的相应

位置。

（2）转化与筛选：将构建的shRNA载体转化至DH5α大肠杆菌

感受态细胞中，挑选阳性克隆进行测序验证。

（1）将构建好的过表达或shRNA干扰慢病毒载体与包装质粒共

转染至293T细胞中，收集细胞上清液，即为慢病毒颗粒。

（2）将慢病毒颗粒感染L929细胞，通过荧光显微镜观察绿色荧

光蛋白（GFP）的表达情况，计算病毒滴度。

（1）将构建好的慢病毒载体感染L929细胞，设置不同的感染复

数（MOI），观察细胞的生长情况和GFP表达情况，确定最佳感染条

件。

（2）收集感染后的细胞，提取RNA和蛋白质，分别进行RT-PCR

和WesternBlot检测Zhangfei基因的表达水平，验证过表达和干扰

效果。

通过以上方法和步骤，我们成功构建了小鼠Zhangfei基因过表

达和shRNA干扰慢病毒载体