免疫学实验2分析和总结.docx

实验1 红细胞与白细胞的计数（必修）

[目的与原理]

掌握鱼类采血技术和鱼类红、白细胞计数的原理和方法，并测定不同鱼类的红、白细胞含量及其差异。采用稀释法计数鱼类单位容积血液内的红细胞和白细胞数。由于血液中红、白血细胞数很多无法直接

计数，故需用适当的溶液将血液稀释。然后将稀释血滴入血细胞计数板上，在显微镜下计数一定容积的红、白细胞数。再将所得的结果换算为每立方mm血液中红、白细胞个数。

[实验对象] 鲤、鲫或草鱼。

[试剂与器材]

显微镜，血细胞计数板29，计数器29，鱼用注射器（1ml或5ml，6号针头），吸血管，凹瓷盘，消毒棉球，纱布，擦镜纸，小试管（14个）及试管架（7个），移液管（1ml及2ml，各7个），红、白细胞稀释液（或0.85—0.9%的NaCl溶液），75%的酒精，蒸馏水，抗凝剂（1%肝素钠溶液或10%草酸钾溶液）。

[实验步骤]

1、熟悉血细胞计数板的构造：血细胞计数板为一长方形厚玻璃板。其中计数室方格大小的划分，各种产品略有不同，但基本原理相同。其中央横沟的两边各有一计数室，两计数室的划分完全相同（图1-5-1）。在显微镜低倍下观察，可见每个计数室用双线划分成9个大方格（图1-5-2）。大方格每边长1.0mm。四角的大方格每个又分为16个中方格，这是用以计数白细胞的。中央的一个大方格用双线分成25个中方格，每个中方格又等分成16个小方格（用单线），中方格每边长为0.2mm，计数红细胞时，数中央大方格的5个中方格（即四角和中央的中方格）内的红细胞数目（图1-5-2）。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1mm，因此，放上盖玻片后，计数板与盖玻片之间的距离为0.1mm，此为计数室的高度。

2、采血及稀释：以2ml移液管在干净的小试管内准确加入红细胞稀释液或0.85~0.9%的NaCl溶液2ml，另用1ml移液管在另一干净的小试管内加入白细胞稀释液0.38ml，备用。

图1-5-1血细胞计数室结构 图1-5-2血细胞计数区

尾动脉取血方法是用注射器从鱼体臀鳍后部插入至椎体腹侧，尾静脉血液顺势流入针管，每尾鱼可用此方法数次采血，但每次针头插入部位应在前次插入之前。

将抽出的血液放入经抗凝剂处理的凹瓷盘内，用微量（血红蛋白）吸血管吸取10μl血液至红细胞稀释液试管内，再吸取20μl血液至白细胞稀释液试管内，轻轻挤出血液并反复吸洗2～3次。然后将血液与稀释液混和均匀，但不可用力振荡，以免细胞破碎。

3、充液：将盖玻片先盖在计数板上，用洁净的吸血管吸取摇匀的稀释血液，然后将吸管口轻轻斜置盖玻片的边缘，滴出少量稀释血液，使溶液借毛细管现象而流入计数室内。但必须注意，如滴入过多时，流出室外凹沟中，易造成盖玻片浮起，体积不准；过少时，经多次充液，易造成气泡，所以都应洗去重新

充液。

4、计数：稀释血液滴入计数室后，须静置2—3分钟，然后低倍镜下计数（显微镜焦距准确，缩小光圈并降低聚光器。使视野较暗）。计数白细胞时，数四角四个大方格内的白细胞总数。计数红细胞时数中央大方格四角的四个中方格和中央的一个中方格（共5个中方格）内的红细胞总数，计数时应循一定的路径以免遗漏或重复。对于分布在划线上的血细胞，依照“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数（图

1-5-3）。

计数白细胞时，如发现每个大方格白细胞数相差10个以上；计数红细胞时，如发现各个中格之间的红细胞数相差超过15个，表示血细胞分布不均匀。应将计数板洗净，重新摇匀稀释血液，再充液计数。

5．计算

红细胞数目：将5个中方格内数得的红细胞总数乘以10，000．即得每立方mm血液中红细胞总数。

图1-5-3血细胞计数方式

（实心圈表示计数的红细胞，空心圈表示不应计数的红细胞）

计算公式为：红细胞数/

mm

3=5个中格红细胞数×稀释

倍数/计数的5个中格容积

（1） 稀释倍数等于稀释液2ml除以加入血10μL（0.01ml），为200倍。

（2） 计数室5个中格容积为0.2×0.2×0.1×5=0.02mm3。

白细胞数目：将4个大方格内数得白细胞总数乘以50，即每立方mm血液的白细胞总数。

计算公式为：白细胞数/ 3=4个大方格白细胞数×稀释倍数/计数的4个大格容积

mm

（1） 稀释倍数等于稀释液0.38ml+血20μL（0.02ml）/0.02ml，为20倍。

（2） 计数室4个大方格容积为1×1×0.1×4=0.4mm3。

[注意事项]

1、各种用具要事前清洗。清洗吸管时按照蒸馏水（两次）→95%酒精（两次）→乙醚（两次）的方法清洗。计数室用蒸馏水洗