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MTT法检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖的影响

目的：检测纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞增殖的影响。方法：体外培养人脂

肪源干细胞，取第三代细胞接种到96孔板，以不同浓度（纤维蛋白与凝血酶比

例：4：1、2：1、8：3、5：2）的纤维蛋白胶浸润提取液培养，用MTT法检测

脂肪源干细胞在不同浓度纤维蛋白胶上的增殖情况。结果：不同浓度纤维蛋白胶

制备的浸泡提取液所培养的人脂肪源干细胞的生长曲线无明显差异。结论：不同

浓度纤维蛋白胶对人脂肪源干细胞的增殖无明显影响，纤维蛋白胶有望成为人脂

肪源干细胞生长的支架材料。

标签：纤维蛋白胶；人脂肪源干细胞；MTT法：组织工程

纤维蛋白胶（fibringlue，FG）是一种可降解、无毒的牛物蛋白制剂。对于

组织工程基质材料的选择，目前所采用的可注射性材料有纤维蛋白胶、聚乙烯类

水凝胶、聚乙烯醇一壳聚糖水凝胶、藻酸盐类、琼脂糖类、透明质酸类、壳聚糖

衍牛物类等。纤维蛋白胶因其良好的牛物相容性，并能促进细胞如干细胞的黏附

与增殖，被用作多种药物、细胞及细胞因子的缓释载体。脂肪源干细胞具有来源

广泛、取材不涉及伦理问题、对患者创伤小、细胞获得量大、无排斥反应等优点，

并具有多向分化的潜能，是理想的组织工程种子细胞。本实验丰要探讨纤维蛋白

胶作为支架对于人脂肪源干细胞（humanadiposetissue-derivedstemcells，ADSCs）

增殖的影响，为人脂肪源T细胞作为种子细胞、纤维蛋白胶作为支架材料的组

织构建研究奠定理论依据。

1材料和方法

1.1材料

DMEM高糖培养基（含青、链霉素）、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清（Gibco

公司，美国）、I型胶原酶（Sigma公司，美国）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国）、

MTT液、二甲基亚砜（DMSO）、纤维蛋白原（Sigma公司，美国）、凝血酶（Sigma

公司，美国）。

1.2脂肪源干细胞的分离、扩增

1.2.1脂肪源T细胞的分离与培养：取脂肪抽吸术后的脂肪组织，组织来源

于20～40岁女性患者，排除自身免疫性疾病、遗传病及其他恶性疾病，患者知

情同意。注射器负压吸引法吸取脂肪组织20ml，PBS冲洗，去除肉眼可见的血

管和纤维结缔组织，无菌镊子、剪刀剪碎脂肪；将处理好的组织移入50ml离心

管，加入等体积0.075%I犁胶原酶于37℃条件下消化2h，期间不时振荡，使脂

肪与酶充分接触；加入含15%胎牛血清的高糖培养基终止消化；1500rpm，5min；

弃去漂浮的脂肪组织和上清，完全培养基制成细胞悬液；接种在lOmm培养皿中，

在37℃、5%C02孵箱内培养，24h后观察细胞贴壁状态，进行第一次换液，弃

原培养基和漂浮细胞，连续培养，2～3d换液。

1.2.2脂肪源T细胞的扩增：待单层细胞融合率达到80%～90%时，用PBS

清洗2次，加入1∶250胰蛋白酶（含EDTA）消化，当细胞变圆并部分脱落时，

加入含15%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打培养区域；收集细胞悬液，以

1∶2～3比例传代，2～3d换液；传至第3代备用。

1.3支架材料的制备

纤维蛋白胶及其浸润提取液的制备：纤维蛋白原、凝血酶按不同比例混合（浓

度4∶1、浓度2∶1、浓度8：3、浓度5：2），制成不同浓度的纤维蛋白胶。分

别接种于96孔板中，每组各设6孔，1个丰孔，5个副孔，共4组。待形成具有

固定强度的纤维蛋白胶后加入150ulDMEM培养液，放入37℃、5%CO2孵箱内

静置48h制备不同浓度纤维蛋白胶的浸润提取液待用。

浸润提取液培养细胞：将第3代人脂肪源干细胞制成lXl03/150ul细胞密度

接种于96孔板中，每孔加入150ul细胞悬液。每组各设6孔，1个丰孔，5个副

孔，共4组，另设一组用常规培养基培养作为对照组。放入37℃、5%C02孵箱

内24h，待细胞贴壁；弃原培养基，PBS清洗2遍，第一组加入纤凝比为4∶1

的浸润提取液，第二组加入纤凝比为2∶1的浸润提取液，第三组加入纤凝比为

8∶3的浸润提取液，第四组加入纤凝比为5∶2的浸润提取液，另设一组用常规

培养基培养的细胞作为对照组，隔天换液。重复两次，结果行多样本X2检验。