饲料中猪源性成分的定性检测 实时荧光PCR法 征求意见稿.docx

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GB/T21101—202X饲料中猪源性成分的定性检测实时荧光PCR法

1范围

本文件规定了猪源性成分的实时荧光PCR检测方法。

本文件适用于饲料（包括饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料）中猪（Susscrofa)）源性成分的实时荧光PCR定性检测。也适用于动物组织及加工品中猪（Susscrofa)）源性成分的实时荧光PCR定性检测。

本文件相对检测下限为0.1%（W/W)，绝对检测下限为5拷贝DNA/PCR反应。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T20195动物饲料试样的制备

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

实时荧光PCRreal-timePCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程3.2

Ct值cyclethreshold

每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）bp：碱基对（basepair）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

Tris：三羟甲基氨基甲烷（trihydroxymethylaminomethane）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）

5原理

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GB/T21101—202X

根据猪β-actin基因的特异性序列设计引物和探针，采用实时荧光PCR技术进行扩增，根据扩增反应中产生的荧光信号和Ct值实现对猪源性成分的定性检测。

6试剂和材料

除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均使用无DNA酶污染的容器存储或分装。

6.1实时荧光PCR试剂（2×实时荧光PCR预混液)。

6.2溶液配置用水：应符合GB/T6682二级水的要求。。

6.3实时荧光PCR用超纯水：不含DNA酶和RNA酶。

6.41mol/LTris-HCl溶液（pH8.0）：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa、121°C条件下灭菌20min。

6.50.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)：称取186.1gNa2EDTA·2H2O溶解于800mL水中，磁力搅拌器上剧烈搅拌，加入NaOH固体约20g，再滴加NaOH溶液调pH至8.0，定容至1000mL，在103.4kPa、121°C条件下灭菌20min，室温保存。

6.6TE缓冲液（pH8.0）：分别量取10mLTris-HCl溶液和2mLEDTA溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa、121°C条件下灭菌20min。

6.7引物和探针：用TE缓冲液将每条引物或者探针分别配制成100μmol/L储存液备用，置-20℃以下冻存，避免多次冻融。序列见表1。

表1引物探针序列

目标物种

名称

序列

基因序列号

18SrRNA基因（内参对照）

18S-179bp-F

5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3’

XR_003508809.1

18S-179bp-R

5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3’

18S-179bp-P

5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’

猪

Porcine-97bp-F

5′-CGTAGGTGCACAGTAGGTCTGAC-3′

DQ452569.1

Porcine-97bp-R

5′-GGCCAGACTGGGGACATG-3′

Porcine-97bp-P

5′-[FAM]-CCAGGTCGGGGAGTC-[NFQ-MGB]-3′

7仪器设备

7.1密闭的样品粉碎仪或研磨机：碾磨细度达到60目，粉碎容器和刀具易于清洗。

7.2离心机：离心速度≥14,000rpm。

7.3紫外分光光度计或微量核酸蛋白测定仪