临床免疫学检验：第七章 荧光免疫技术.ppt

基本原理解离增强技术增强液作用机理：加入酸性增强液后，可以使Eu3+从反应复合物中解离下来，游离的Eu3+同增强液中的另一种螯合剂形成一种胶态分子团，这种分子团在激发光的激发下能够发出强烈荧光，信号可以增强百万倍。标记方法双功能螯合剂：1-（对-苯偶氮）-EDTA异硫氰酸苯基-EDTA异硫氰酸苯甲基-DTTA二乙烯三胺五乙酸（DTPA）方法类型双抗体夹心法固相抗体竞争法固相抗原竞争法双抗体夹心法荧光淬灭定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等应用：避光保存荧光物质，避免沾染这些物质；利用荧光淬灭剂来消除非特异性荧光荧光的基本知识荧光色素的要求1、能与蛋白质形成共价键，结合后不易解离，未结合的易清除2、荧光效率高，且与蛋白结合后仍保持较高的荧光效率3、荧光色泽与背景的色泽对比度高4、与蛋白结合后不影响蛋白的免疫活性5、标记方法简单，安全无毒6、标记物稳定，易于保存二、荧光物质荧光物质最大吸收波长最大发射波长应用异硫氰酸荧光素(FITC)490～495nm520～530nm（黄绿色）FAT、荧光偏振免疫测定藻红蛋白（PE）565nm578nm（橙红色）双标记FAT、流式细胞术四乙基罗丹明(RB200)570nm595～600nm（橘红色）FITC的对比染色或双标记FATEu3+螯合物340nm613nm时间分辨荧光免疫测定荧光底物荧光酶免疫测定常用的荧光色素荧光免疫技术荧光免疫技术荧光抗体技术荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定荧光偏振免疫测定

第二节荧光抗体技术

荧光抗体技术的基本原理又称免疫荧光显微技术或荧光免疫组织化学技术，是以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记特异性抗体或抗抗体，检测固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体，常用于定性和定位检查的一门技术。荧光抗体技术的内容荧光抗体制备标本的制作荧光抗体染色荧光显微镜检查一、荧光抗体的制备高特异性高亲和力通常采用单克隆抗体抗血清应不含针对标本中正常组织的抗体成分，需经纯化IgG后再标记抗体要求制备原理利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。制备方法搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体溶液。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性荧光染色。透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异荧光染色较低。目的：去除未结合的游离的荧光素方法：透析法、凝胶过滤法荧光抗体的纯化荧光素与蛋白结合比率：荧光素（F）结合到抗体蛋白（P）上的量F/P=（A280nm=1.0）F/P越大，表明抗体分子结合的荧光素越多荧光抗体染色以1.5为宜，活细胞染色以2.4为宜荧光抗体的鉴定抗体效价：双扩，1:16抗体特异性：吸收试验、抑制试验小量分装，避光4℃:半年-20℃：保存2～3年真空干燥：长期保存稀释抗体：4℃1～3天荧光抗体的保存常见临床标本：组织、细胞和细菌切片：冷冻切片、石蜡切片印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液二、标本的制作三、荧光抗体染色与结果判断荧光抗体染色方法直接法间接法直接法间接法双标记法两种荧光素分别标记两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光，用于检测同一标本内的两种抗原。设立实验对照：阳性对照和阴性对照区分特异和非特异染色阳性细胞显色分布：胞质型、胞核型和膜表面型荧光抗体染色的结果判断“-”：无或仅见极微弱荧光。“+”：荧光较弱但清楚可见。“++”：荧光明亮。“+++”：耀眼强荧光。特异荧光强度“+”以上判定为阳性，对照光应呈“-”或“±”。根据呈+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。结果判断四、荧光显微镜光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯滤光片：隔热、激发和吸收滤光片聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光器目镜：消色差镜头隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长的光域，提供合适的激发光。吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。滤光片光路基本原理将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光