临床免疫学检验：第十二章 免疫组织化学技术.ppt

缺点：有些组织如肝、肾、白细胞、脂肪组织和乳腺等有内源性生物素活性，需要对组织进行预处理?ABC复合物在中性时带正电荷，容易与细胞核等带负电荷结构非特异结合亲合素为糖蛋白，可以与凝集素等碳水化合物结合优点：敏感性高特异性高一抗和二抗工作浓度低操作时间缩短可以多重标记桥联亲合素-生物素技术

BridgedAvidin-Biotintechnique，BRAB原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来，达到检测反应分子的目的。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。BRAB直接法原理示意图待测抗原非特异性抗原A-亲合素B-生物素E-酶BRAB间接法原理示意图待测抗原非特异性抗原A-亲合素B-生物素E-酶标记生物素-抗生物素技术

LabelledAvidin-biotintechnique，LAB原理:以标记亲合素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。特点:相当高的灵敏度，省略了加标记生物素步骤，操作较BRAB法简便。间接LAB法采用生物素化第二抗体，可进一步提高检测灵敏度YYYBYYBEEEYYBEEEYYYYYBYYBYYYYBEEEEEEEEEYYBYYBEEEEEEEEE二、链霉亲合素-生物素法(LSAB）链霉亲合素(StreptavidinSA)是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有4个生物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲合素。利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合素-生物素方法LSAB法具有几大特点：酶标记在SA上，与生物素结合的位点呈游离状态，可结合更多的生物素化的二抗，放大效应远远超过ABC法（1-2倍）低背景着色：等电点比亲和素低，带正电荷少，与带负电荷的结缔组织结合少，背景染色低。操作时间缩短（孵育时间短），抗体用量少。三、葡萄球菌A蛋白法定义:葡萄球菌蛋白A（SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它能与多种动物IgG的Fc段结合，用SPA标记物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的各种免疫检测实验SPA可以和人及多种动物的IgG结合，解决不同动物样本检测时，需分别标记相应二抗的问题SPA结合部位是Fc段，因此不会影响抗体的活性SPA具有双价结合力SPA对IgG?亚型的结合有选择性，可能出现的假阴性结果三、凝集素法凝集素（lectin）是指一类从植物种子、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，可使红细胞凝集故称凝集素。凝集素具有与特定糖基专一结合的特性，是研究肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具。凝集素法就是一方面利用凝集素可以与标记物结合，另一方面又可以与细胞膜糖基结合所形成一种亲和反应。直接法是将标记物直接标记在凝集素上，与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合。间接法是先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体与结合在细胞上的凝集素反应-凝集素-糖法，这种方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个“三明治样”的结合物。第六节免疫组化技术的应用荧光免疫组织化学技术的应用肾小球抗基底膜抗体的阳性显色自身免疫性疾病中的应用病原体检测SARS感染的细胞酶免疫组织化学技术的应用提高病理诊断准确性（HE可观察到炎性细胞浸润，ED1染色可观察到巨噬细胞浸润）Survivin在肝癌细胞核的表达癌基因蛋白的临床应用对肿瘤细胞增生程度的评价Ki67在小肝癌组织中的表达肿瘤的靶向治疗抗体的保存分装密封保存，避免对抗体的污染并注明标记（批号、名称、效价、量）根据厂家提供的保存条件保存避免反复冻融而使抗体效价降低四、结果判断对照实验：阳性对照：选择含已有抗原的标本(证明整个显色程序正确，尤其待检标本呈阴性结果时更为重要）阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）确证实验：空白实验：PBS（排除内源性酶）替代试验：与待测抗原的同种动物非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗原引起的非特异性反应）吸收或阻断试验：用过量已知抗原（可溶性）与特