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ITPG诱导方法

1、诱导

将BL-pET-FAT/CD36菌液接种到4mLLA液体培养基中，37℃，200rpm振

摇培养过夜。

（IPTG浓度）取100µL培养过夜的菌液接种到5mLLA液体培养液中，共接

8管，37℃，200rpm振摇培养至OD至0.6~0.8时，加入1M的IPTG，使IPTG

600

终浓度分别为使IPTG终浓度分别为0，0.01，0.1，0.2，0.5，1，5，10mM，置

37℃摇床继续培养4h，置4℃保存备用。

另取不含外源基因片段的质粒pET-32a(+)转化BL21感受态细胞作相同处理，

加IPTG诱导4h作为对照。样品处理后进行SDS分析。

（诱导时间）取100µL培养过夜的菌液接种到5mLLA液体培养液中，共接

8管，37℃，200rpm振摇培养至OD至0.6~0.8时，加入1M的IPTG，使IPTG

600

终浓度为0.5mM，进行诱导表达，分别在诱导0、1、2、3、4、6、8、12h时，

每次取出一个离心管，置4℃保存备用。

另取不含外源基因片段的质粒pET-32a(+)转化BL21感受态细胞，加IPTG诱

导4h作为对照。样品处理后进行SDS分析。

2、样品处理（0.5mM、6h找出最佳IPTG浓度和诱导时间）

取100µL培养过夜的菌液接种到5mLLA液体培养液中，37℃，200rpm振

摇培养至OD至0.6~0.8时，加入1M的IPTG，使IPTG终浓度为mM，

600

诱导h，10000rpm离心1min收集菌体，弃上清。

在细菌沉淀中加入1mL1×结合缓冲液，冰浴超声50次，每次4s，间隔9s，

超声结束后13000rpm离心30min，分离上清和沉淀。

取上清50µL，加入50µL2×SDS上样缓冲液；沉淀加入500µL1×SDS上样缓

冲液，均在100℃水浴加热5min，用于SDS电泳

3、SDS分析

（1）样品的处理

取1mL菌液，10000rpm离心1min，弃上清，重悬于100µL去离子水，

加入100µL2×SDS凝胶上样缓冲液，涡旋混匀，100℃加热3-5分钟，10000rpm

离心3min备用。

（2）SDS凝胶的制备

①按下列配方组成配制4mL12%分离胶

HO1.32mL，30%凝胶贮备液1.6mL，分离胶缓冲液1mL，10%SDS0.04mL，

2

10%过硫酸铵0.04mL，最后加入TEMED0.002mL。

②一旦加入TEMED，混匀后立即小心将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，注

意为积层胶留有足够的空间。轻轻在其顶层加入2mL去离子水，覆盖凝胶，

以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

③聚合完成之后，倒掉覆盖在凝胶上层的液体，尽可能用滤纸吸干凝胶顶层的残

存液体。

④按下列配方组成配制1mL5%积层胶

HO0.675mL，30%凝胶贮备液0.1675mL，积层胶缓冲液0.125mL，10%SDS

2

0.01mL，10%过硫酸铵0.01mL，最后加入TEMED0.001mL。

将积层胶灌入分离胶上面，插入梳子，垂直放置于室温下。

⑤积层胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔。将凝胶放入电泳槽上，加入电泳缓

冲液，小心拔出梳子。

（3）电泳

①安装好电泳槽，将电极插头与适当的电极相连。

②开始时电压为8V/cm，染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm。继续电泳

直到染料到达分离胶底部，断开电源。

③取下凝胶，将凝胶置于考马斯亮蓝染色液中放摇床上缓慢旋转3-4小时或过夜。

④换掉并回收染色液。用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动4-8小时，其间换液3-4次。

继续脱色，直到满意为止。

⑤用凝胶成像系统对凝胶进行照相和分析。