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药物化学生物学演示

——Pull-Down技术

药学122王静

Pull-Down文献查找过程Pull-Down技术技术相关4123主要内容文献内容简介

Pull-Down网站：

Pull-Down来源：NatureChemicalBiologyIF：13.217（15.059）时间：2014.9.14SCi分区：1区（大类：生物小类：生化与分子生物学）

Pull-Down拉下实验（Pull-downassay）拉下实验又叫做蛋白质体外结合实验（bindingassayinvitro），是一种在试管中检测蛋白质之间相互作用的方法。在Pull-Down实验中，带有标签的诱饵蛋白被特异结合该标签的固相化亲和配基捕获，产生“次级亲和支持物”，用于纯化与诱饵蛋白相互作用的其他蛋白。含有固相化诱饵蛋白的次级亲和支持物可以与含有推测猎物蛋白的各种蛋白样品相互孵育。如果缓冲液及样品条件与靶结合相互作用兼容，且诱饵蛋白在带有标签和被固相化时仍然可以行使功能，那么存在于样品中的猎物蛋白就会结合到亲和支持物上。如果特异结合相互作用的亲和性足够强，那么非结合的样品成分可以被洗涤掉，进而纯化形式的猎物或诱饵-猎物复合体可被从支持物上洗脱下来。洗脱结合物后通过SDS电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

Pull-Down

Pull-Down1，将特异性标记的蛋白质探针在载体内表达并纯化2，平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记),3，再将标记过的融合蛋白探针和细胞裂解液在某种合适球珠存在情况下混合并孵育,以使蛋白结合.4，标记融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集5，获得的混合物经洗涤后,用过量游离合适的洗脱液洗脱或直接在SDS上样缓冲液中煮沸.6，蛋白质经SDS分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析.具体过程

Pull-Down

Pull-Down来自肯塔基大学的研究人员通过研究发现了一种名为Arylquin1的新型分子，其可以作为正常细胞分泌Par-4的诱导因子，Par-4是一种抑制肿瘤的蛋白质，在正常细胞未受伤害时其可以有效杀灭癌细胞。正常的细胞会分泌少量的Par-4分子，但是这种含量并不足以杀灭癌细胞，而值得一提的是，如果Par-4的分泌被抑制就会促进肿瘤生长；文章中研究人员在实验室利用培养基和动物模型进行研究揭示了，低水平的Arylquin1分子在不损伤生产细胞（产生Par-4分子）时，其会诱导Par-4分子的分泌，从而抑制肿瘤细胞。

Pull-DownArylquin1：3-芳基喹啉衍生物，一种分泌Par-4的诱导因子，可以助细胞抑制肿瘤细胞生长。本实验中小分子物质为Arylquin1，靶标蛋白为Vimentin蛋白，需要特定的溶解液与洗脱液，标记物为streptavidin。波形蛋白（Vimentin）是中间丝的其中一种蛋白质。中间丝是真核生物细胞的重要结构性特征。它们与微管及肌动蛋白微细丝，组成细胞骨架。

Pull-DownToidentifythetargetproteinforcompoundArylquin1,pulldownexperimentswereperformedasdescribedpreviously17.MEFsorHELcells(growntoconfluencein15-cmplates)werelysedin50mllysisbuffer(40mMHepes,pH7.8,140mMNaCl,10mMNaF,10%glycerol,1mMEDTA,1%Triton100),andthelysateswerepreclearedat4°Cfor1hwith100μlstreptavidinbeads(Novagen,Strep-TactinSuperflowAgarose).Bindingreactionswereperformedbyincubatingthepreclearedcelllysateswith50μlbeads±25μgofbiotinylatedArylquin1at4°Cfor2h.Thebeadswerethenwashedfourtimeswithbuffer(40mMHepes,pH7.8