T载体与目的基因连接.pdfVIP

一.重组质粒的构建T质粒载体

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2、ATP存在

的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连

接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接

酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在

一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接

酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种

连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA

连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体

DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与

辅因子ATP形成酶-ATP复合物；然后，酶-ATP复合物再结合到具有

5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最终产生一个新的

磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相

连。

许多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条

链的3’端加上一个突出的碱基A。pUCm-T载体是一种已经线性化的

载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这，pUCm-T载体的两

端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，

就可以把PCR产物连接到pUCm-T载体中，形成含有目的片断的重组

载体。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度

下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此实行折中的温度，即12-16℃，

连接12-16h（过夜），这既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾

到短暂配对结构的稳定。

二.感受态制备原理

细菌在0°CCaCl2低渗溶液中胀成球形，丢失部分膜蛋白，成为简

单汲取外源DNA的感受态。

三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法

LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码—半乳

糖核苷酶。—半乳糖核苷酶是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖

的水解．用X-Gal为底物进行染色时，呈蓝色。

现在一些特定的质粒（比如pUC/pBS等），常带有—半乳糖核苷酶

的调控序列和—半乳糖核苷酶N端146个氨基酸（α肽段）的编码序列，

在这个编码序列里还插入一个多克隆位点（MCS）,它并不影响lacZ的

表达。另外，常用的大肠杆菌带有—半乳糖核苷酶C端部分序列（肽

段），的编码序列。在各自独立的状况下，这些质粒与大肠杆菌各自编

码的—半乳糖核苷酶片段都没有酶的活性。只有当携带α肽编码信息

的克隆载体胜利进入宿主细胞，在培育基诱导物IPTG的诱导下，载体

质粒能够合成—半乳糖核苷酶N端（α肽段），这就与宿主细胞合成

的—半乳糖核苷酶C端部分序列（肽段）互补，形成完整的—半乳糖

核苷酶活性蛋白。

而当外源基因插入到此种载体质粒lacZ的多克隆位点后，会造成

lacZ基因不能表达，从而不能合成—半乳糖核苷酶；而对于空载体，

lacZ基因正常表达，通过α互补合成—半乳糖核苷酶，分解培育基里

的色素底物X-gal，最终形成蓝色的化合物，出现蓝色菌斑。

试验打算：清洗，5个100ml锥形瓶（外加1个小的），6副培育皿，3个

小试剂瓶，接种环，涂布棒。打算100ml超纯水。溶液:LB300ml(液体

50ml+50ml，固体100ml)，0.1mol/LCaCl210ml，100mg/mlAmp1ml，

20mg/mlX-gal1ml，200mg/mlIPTG1ml。大肠杆菌菌液1ml。

感受态细胞