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马铃薯镰刀属真菌病害检测技术规程

1范围

本文件规定了马铃薯镰刀属真菌病害检测的原理、仪器设备和用具、形态检验、致病性测定、PCR

检验、样品复检等技术要求和方法。

本文件适用于马铃薯镰刀属真菌病害的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

SN/T2729马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

镰刀属真菌(Fusariumspp.)是一种重要的植物病原菌，属无性真菌类，有性时期为子囊菌门。镰

刀属真菌主要危害马铃薯植株和块茎。本标准以病原菌在植株和块茎上的危害症状，菌落、孢子等形态

学特征，回接致病性测定及PCR反应结果为鉴定依据，将上述各项措施综合形成一套检测技术体系。

5仪器设备和用具

仪器设备

超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、光照培养箱、PCR仪、离心机、凝胶电泳仪、漩涡震荡仪、水

浴锅、凝胶成像系统、分析天平。

检测工具

接种针、手术刀、镊子、挑针、载玻片、盖玻片、滴管、离心管、培养皿、三角瓶、酒精灯。

6形态检验

调查取样

选取田间萎蔫、干枯发病植株，观察根部腐烂情况，检查是否褐变或出现白色菌丝体；剖开根茎处

维管束观察是否出现黄化或褐变；田间或窖藏观察马铃薯块茎病变情况，在块茎脐部下方2cm左右处横

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切，或切取表皮凹陷病斑处进行观察，观察是否出现维管束褐变，块茎中空或腐烂并伴随白色菌丝层。

将具有典型特征的病株、病薯取样。

病原菌分离培养和纯化

将病样表面清洗晾干，选择病斑附近的病健交界处，切取0.3cm×0.3cm×0.1cm大小的薄片，75%

酒精消毒30s，用无菌滤纸吸干，在0.1%次氯酸钠浸泡2min，再用无菌水冲洗3次。待组织干燥后置于

PDA培养基上，在25℃恒温下光照、黑暗交替各12h培养5d。待组织长出菌丝后，挑取菌丝体转移到

新的PDA培养基上进行培养。待菌落长至培养皿2/3时，采用平板稀释法进行单孢分离，并获得纯培养。

病原菌形态学鉴定

将PDA培养基上培养7d的菌落拍照并观察其形态，典型菌落气生菌丝多呈絮状或毡状，白色、紫色、

淡粉色或黄白色。利用挑针挑取少量菌组织，载玻片上以水浮载制成玻片，显微镜下观察孢子形态，小

型分生孢子呈卵圆形或椭圆形，单孢，大小2µm～4µm×4µm～8µm；大型分生孢子略弯曲，镰刀形或

月牙形，2～5个分隔，多为3个分隔，大小3µm～8µm×11µm～70µm；厚垣孢子球形，表面不光滑，

单生或串生。

7致病性测定

将纯培养物配制成孢子悬浮液，伤口接种法进行马铃薯植株和薯块回接，接种28d后观察马铃薯的

发病情况。如出现与病样一致的症状则判定病原菌能够引起该病害发生。

8PCR检验

DNA提取

按照SN/T2729，采用CTAB法提取菌株基因组DNA。

对照设置

以马铃薯枯萎病病原菌DNA作为阳性对照，以不添加DNA模板反应体系作为阴性对照。

PCR扩增

以菌株DNA为模板，利用镰刀菌属真菌的特异性引物EF-1H：（5ʹ-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3ʹ），EF-

2T：（5ʹ-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3ʹ）进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μL，其中模板DNA1μ

L，上下游引物各1μL，2×EasyTaqPCRSuperMix12.5μL,ddHO9.5μL。PCR扩增程序：95℃

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预变性5min；95℃30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸5min。

结果判定

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增出长度介于700bp～750bp之间的清晰单一条带，与阳性

对照一致。

9样品复检

2

样品检测不成功需要复检，病样置于冰箱-20℃冷冻以