蛋白质分离纯化技术专家讲座.pptx

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蛋白质分离与纯化技术蛋白质（protein）是生命物质基础，没有蛋白质就没有生命。所以，它是与生命及与各种形式生命活动紧密联络在一起物质。机体中每一个细胞和全部主要组成部分都有蛋白质参加。蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物当中分离纯化出所需要目标蛋白质方法。因为深入研究蛋白质结构与功效需要用到高纯度蛋白质，所以蛋白质分离与纯化技术是生物产业中关键技术。蛋白质分离纯化技术专家讲座第2页

普通程序预处理蛋白质抽提蛋白质粗分级蛋白质纯化蛋白质分离纯化技术专家讲座第3页

预处理分离提纯某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来组织或细胞中以溶解状态释放出来，并保持原有天然状态，不丧失生物活性。惯用破碎方法有：机械方法：如均浆喷射、研磨或超声波化学法：如去污剂、有机溶剂处理酶学方法：如溶菌酶处理蛋白质分离纯化技术专家讲座第4页

蛋白质抽提普通蛋白质通常选择适当缓冲溶液把蛋白质提取出来，再用离心法除去不溶物得到含有目标物粗抽提液。抽提所用缓冲溶液PH值、离子强度、组成成份等应依据目标蛋白质性质而定。蛋白质分离纯化技术专家讲座第5页

蛋白质粗分级采取分级盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法将目标蛋白质与其它蛋白质分离开来。蛋白质分离纯化技术专家讲座第6页

蛋白质纯化在蛋白质纯化过程中，从细胞破碎一步开始蛋白质就脱离了天然环境，受到各种不一样试剂干扰，其结构和功效会受到不一样程度可逆或不可逆损害。所以，在蛋白质纯化各步骤都要小心地控制所采取提纯条件，以防止蛋白质变性。在提纯蛋白质过程中需要在每一步检测蛋白质（酶）存在及提纯情况，即建立蛋白质定量检测方法。蛋白质分离纯化技术专家讲座第7页

蛋白质纯化惯用方法采取分离和提纯蛋白质各种方法，主要是利用蛋白质之间各种特征差异：依据分子大小不一样分离方法利用溶解度差异分离方法依据蛋白质吸附性质分离依据对配基生物学特异性依据蛋白质分离蛋白质分离纯化技术专家讲座第8页

依据分子大小不一样分离方法透析和超滤：利用蛋白质分子不能经过半透膜性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。离心分离：蛋白质和杂质溶解度不一样时能够利用离心方法将它们分开，经常和其它方法联合使用一个分离蛋白质方法。凝胶过滤层析：利用凝胶介质交联度或者孔度（网孔大小）来决定凝胶分级范围。蛋白质分离纯化技术专家讲座第9页

利用溶解度差异分离方法等电点沉淀和PH值控制：等电点时蛋白质净电荷为零，溶解度最低。相反,有些蛋白质在一定pH值时很轻易溶解。因而能够经过调整溶液pH值来分离纯化蛋白质。蛋白质盐溶和盐析：中性盐显著影响球状蛋白质溶解度现象,其中,增加蛋白质溶解度现象称盐溶,反之为盐析。有机溶剂分级法：与水互溶有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中溶解度显著降低。而且在一定温度、pH值和离子强度下,引发蛋白质沉淀有机溶剂浓度不一样,所以,控制有机溶剂浓度能够分离纯化蛋白质。蛋白质分离纯化技术专家讲座第10页

依据蛋白质吸附性质分离一些物质，如极性硅胶和氧化铝以及非极性活性炭等，含有吸附能力，能够以不一样强弱吸附力吸附蛋白质。吸附层析法就是利用这种吸附力强弱不一样而到达分离目标。蛋白质分离纯化技术专家讲座第11页

依据对配体特异亲和力进行纯化配基是指能被生物大分子识别并与之结合原子、原子团、分子。如酶作用底物、辅酶及其结构类似物。亲和层析，这是一个高效分离纯化蛋白方法。其原理是不一样蛋白质分子对于固定化在载体上特殊配基含有不一样识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质含有特殊识别和结合作用配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基载体装入层析柱中，当含有待纯化蛋白质溶液经过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上蛋白质，能够用适当配体洗脱液洗脱。蛋白质分离纯化技术专家讲座第12页

依据蛋白质带电状态分离离子交换层析IEC是依据蛋白质两性解离性质、在溶液中所带电荷不一样进行分离。离子交换层析中,基质由带有电荷树脂或纤维素组成。带有正电荷为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。当蛋白质处于不一样pH值条件下,其带电情况也不一样。阴离子交换基质结合带有负电荷蛋白质,被留在层析柱上,经过提升洗脱液中盐浓度,将吸附在层析柱上蛋白质洗脱下来,其中结合较弱蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷蛋白质,结合蛋白能够经过逐步增加洗脱液中盐浓度或是提升洗脱液