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SOD活性的测定-邻苯三酚自氧化法

定义：25℃时抑制邻苯三酚自氧化速率50%时所需的SOD量为一个活力单位。

按照GB/T5009.171-2003中邻苯三酚自氧化的方法测定酶活力，利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。

一、试剂：

1、pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液：

A液:称取17.9gNa2HPO4?12H2O于容量瓶中定容至1L；

B液:称取7.8gNaH2PO4?2H2O于容量瓶中定容至1L；

取A液91.5mL和B液体8.5mL混匀得到pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液。

2、C液:pH8.20，0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲液(内含1mmol/LEDTA?2Na)：

称取1.2114gTris和37.2mgEDTA?2Na溶于62.4mL0.1mol/L盐酸溶液中，用蒸馏水定容至100mL。

3、0.lmol/L盐酸溶液:量取2.lmL12mol/L盐酸，蒸馏水定容至250mL。

4、.10mmol/L盐酸溶液:量取10mLO.lmol/L盐酸，蒸馏水定容至l00mL。

5、D液:4.5mmol/L邻苯三酚盐酸溶液：

称取邻苯三酚(A.R)56.7mg溶于少量的10mmol/L的盐酸溶液，并定容至100mL。

二、仪器：

1.冷冻离心机

2.水浴锅；

3．电子天平；

4．紫外-可见分光光度计；

5．精密酸度计，精确到0.01pH；

6．10mL比色管；

7．10mL离心管；

8．玻璃乳钵。

三、实验步骤

1．SOD粗酶液的提取

称取叶片1g，置于研钵中研磨，加入3mL0.05mol/L磷酸缓冲液，加入少量石英砂，继续在冰浴中的研钵内研磨成匀浆，取4mL至离心管中，于4℃10000r/min离心20min，

2.1邻苯三酚自氧化速率测定

在25℃左右，于10mL比色管中依次加入C液体2.35mL，磷酸缓冲液2.00mL,D液0.15mL。加入D液后立即混合均匀并倾入比色皿，分别测定在325nm波长条件下初始时和1min后吸光值，二者之差即邻苯三酚自氧化速率ΔA325(min-1)。

2.2样液抑制邻苯三酚自氧化速率测定

样液抑制邻苯三酚自氧化速率测定按照2.1步骤分别加入一定量样液使抑制邻苯三酚自氧化速率约为1/2ΔA325(min-1)，即ΔA325(min-1)。

SOD活性测定加样表

试液

空白

酶提取液1

酶提取液2

C液/mL

2.35

2.35

2.35

磷酸缓冲液/mL

2

1.5

1.5

样液/mL

0

0.5

0.5

D液/mL

0.15

0.15

0.15

于10mL比色管中立即混合均匀然后倾入比色皿

式中:

U/mL一SOD酶活力单位;

△A325一邻苯三酚自氧化速率;

△A`325一样液或SOD酶液抑制邻苯三酚自氧化速率;

V一所加酶液或样液体积，单位为毫升(mL);

D一酶液或样液的稀释倍数;

V1一样液总体积，单位为毫升（mL）；

m一样液质量，单位为克（g）

4.5一反应液总体积，单位为毫升(mL)。

计算结果保留三位有效数字。