transwell实验原理与步骤.pdfVIP

一、Transwell小室制备

1.无基质胶Transwell小室制备

①包被基底膜：

用50mg/LMatrigel1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风

干。假如须要在下室面铺FN的话，可将200ul枪头的尖端剪掉,吸取FN匀

称涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5mg/ml，干脆用

枪吸了涂在膜上。

②水化基底膜：

吸出培育板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培育液，37

℃，30min。另有tianjin_glioma战友供应的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加

入稀释后的Matrigel(3.9ug/ul)60-80µl(留意体积不行太大，以刚把聚碳

酸酯膜浸湿为最好)，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

2.有基质胶的Transwell小室制备

Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培育板中，在上室

加入300µl预温的无血清培育基，室温下静置15－30min，使基质胶再水

化。再吸去剩余培育液。

二、制备细胞悬液

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的

影响。但这一步并不是必需的。

②消化细胞，终止消化后离心弃去培育液，用PBS洗1－2遍，用含BSA

55

的无血清培育基重悬。调整细胞密度至1-10×10，个人认为不要超过5×10。

详细试验时采纳密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭实力是不同的。个

人阅历，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，假如最终用计数法统计

结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，全部的细胞

都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有确定量的细胞

存在。个人认为，比照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异

会严峻影响试验结果。假如须要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计

数确定要多重复几次，力求精确，尽量保证比照组和处理组细胞密度一样。

三、接种细胞

①取细胞悬液100－200µl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的

Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般

200µl。

②24孔板下室一般加入500µl含FBS或趋化因子的培育基，不同的培育

板加的量有不同要求，详细请参考说明书。这里要特殊留意的是，下层培

育液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培育液的趋化作用就

减弱甚至消逝了，在种板的时候要特殊留心，一旦出现气泡，要将小室提

起，去除气泡，再将小室放进培育板。

③培育细胞：常规培育12－48h（主要依癌细胞侵袭实力而定）。时间点的

选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不行

忽视。

以我的课题为例，我运用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增

殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72h的IC50。用这个

浓度处理细胞，24h内对细胞增殖并无明显抑制，但24h后，抑制作用就起

先出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必需限定在24h

内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少

于比照组，那么就难以确定穿过膜的细胞比比照组少，原委是由于侵袭被

抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比比照组少而引起的了。

时间过长不行以，同样，过短也不行，因为细胞内会有确定量的MMPs储

存，短时间内可能侵袭实力不会有太大变更。同时从药物被汲取进去，进

而发挥作用，影响MMPs表达，到最终释放到培育基中，还须要一个过程。

时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点探讨时间依靠效应，但前提

是这个时间范围内细胞数目不能有明显变更。另外，我看到细胞在小室内

的形态不是正常培育贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过

会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也没关系张，是正常现象

在培育过程中，膜下会渐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处

理，但我遇到过培育一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏与时发觉，否则

后果将特别严峻。因此，个人建议，最好接种