免疫组织化学与杂交组化原理和实验.pptx

第一章理论基础theoreticbasis

免疫组织化学和杂交组织化学是一门原位示踪染色技术。学科交叉产物。;理论基础是基于利用放射性核素和其它标识物（荧光素，酶，重金属离子等）作为示踪剂，经过免疫亲和（抗原-抗体特异性结合）和核酸杂交（碱基配对特异性连接）路径，在组织切片或细胞涂片上，原位显示生物大分子动态改变而建立一门染色技术。;基本特点是“特异,灵敏，准确，形态、机能、代谢三位一体”，系分子病理学研究惯用伎俩。;学习重点有四：

1.名词概念；

2.技术原理；

3.操作要领；

4.结果判断标准

（尤其是对照染色和假阳性假阴性判别）。;第一节抗原

1.抗原概念凡能在机体内引发体液免疫和/或细胞免疫反应物质,称为抗原。;抗原主要含有两方面特征，抗原能引发机体产生抗体和/或致敏淋巴细胞，称之为免疫原性；抗原还与对应抗体及致敏淋巴细胞发生特异性结合或反应，称为免疫反应性。;有免疫原反应性而缺乏免疫原性抗原称为半抗原，半抗原与载体（通常是大分子物质）结合，可变为全抗原，载体不但增加半抗原大小，可在体内激发免疫反应，而且还直接与免疫记忆相关。;2.抗原化学结构

一个天然抗原含有二种结构，一是高分子载体（抗原性）；二是抗原决定簇（特异性）。;抗原决定簇（antigenicdeterminant）又称抗原表位（epitope.)是指抗原分子上含有决定和控制抗原特异性特殊化学基团,可与对应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合部位。大多数蛋白质抗原可有多个抗原决定簇,但因为空间位阻作用,在同一时间内仅有部分抗原决定簇暴露和对应抗体结合。;3.抗原性质及种类异性`大分子`特异为抗原共同性质，凡种系越远`分子量越大`构型越复杂`抗原决定簇暴露越多，则其抗原性越强，特异性越高。抗原特异性是临床诊疗`预防`治疗基础。;抗原类型繁多，分类方法也很多，故抗原名称各种各样（表1-1-1）。抗原有可溶和不溶性两类，后者主要包含一些颗粒性抗原，如细胞`细胞器`一些病原体等。依据性质，抗原又可分为：;①结构抗原，为组成???胞结构成份，如细胞骨架蛋白；

②分泌抗原，为细胞所产生和分泌酶`激素`粘液蛋白等；

③沉淀抗原，如肾小球肾炎时，沉淀在肾小球基膜免疫球蛋白`补体和免疫复合物等；

④入侵抗原，主要指病原微生物。;4.抗原分离纯化普通标准

免疫组化方法检测抗原中，蛋白质占了大多数，故此处叙述普通标准以蛋白抗原为主要对象。;⑴首先选择和建立抗原检测方法目标是跟踪监测一系列提纯过程中抗原是否存在，其含量和活性怎样。方法有特异和非特异之分，前者利用抗原特异反应，后者利用抗原已知理化特征。;⑵选择抗原含量高组织为材料

组织中欲提抗原含量越高，提纯也越轻易，且得率越高。;⑶操作中应保持抗原分子稳定性

如低温、严格pH、预防巯基氧化、在缓冲液中加入浓度1―3×10ˉ4MEDTA（乙二胺四乙酸）以螯合除去重金属离子、预防蛋白酶水解作用，等等。;5.抗原分离纯化普通步骤

⑴增溶溶解惯用方法有①渗透溶胞;②研磨;③绞切;④超声波;⑤挤压,等。

⑵分离纯化标准是“先粗后细，先简后繁，先盐析后层析”。

⑶抗原纯度判定方法有：琼脂双扩散、免疫电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、等电点聚焦电泳等。;6.惯用分离纯化方法计有：

⑴差异溶解法其中最惯用是盐析法，又以中性盐硫酸铵最为惯用。;⑵层析法其中有①离子交换层析（DEAE、CM、QAE等）；②选择性吸附层析，如羟基磷灰石可选择性地吸附中性和酸性蛋白而排除硷性蛋白；③分子筛层析（葡聚糖凝胶）；④亲和层析。

⑶制备电泳法如PAGE制备电泳分离条带切割等。;第二节抗体

1.抗体概念抗体（antibody）是机体经过体液免疫，由B淋巴细胞活化、增殖、分化浆细胞合成并分泌与刺激抗原发生特异性结合反应免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。;抗体是免疫球蛋白，而免疫球蛋白不都含有抗体活性。二者在概念上并不完全等同，抗体是生物学和功效上命名，而Ig是结构和化学本质上概念。;2.抗体基本结构

①因为无抗体话性Ig普通极少见，故抗体与Ig可认作为同义词。人类Ig有五类，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，是由其分子结构中对应重链（H链）—α.δ.ξ.γ和μ决定。重链不一样，Ig类型就不一样。轻链（L链）则在同一抗体