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综合性试验蛋白质的分离提取SDS;蛋白电泳及印迹技术(一)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
;一、目的与要求
1.学习电泳原理和技术;
2.学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术;
;1.电泳的基本原理;
2.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
阴离子去污剂SDS(十二烷基硫酸钠)可与蛋白质相互作用,破坏蛋白质分子的非共价键,使蛋白质变性,失去原有的空间构象,形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物,使各种蛋白质分子间原有的电荷差异被消除或大大降低,仅保留了分子大小的差异。
蛋白质分子在电场中的迁移速度仅仅取决于各自分子的大小。当与标准分子量的蛋白质相比较,可以得出各蛋白质分子的分子量大小。
;3.聚丙烯酰胺凝胶有下列特性:
(1)在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好;
(2)化学性能稳定,与被分离物不起化学反应;
(3)对pH和温度变化较稳定;
(4)几乎无吸附和电渗作用,只要丙烯酰胺纯度高,操作条件一致,则样品分离重复性好;
(5)样品不易扩散,且用量少,其灵敏度高,可达10-6g;
(6)凝胶孔径可调节,根据被分离物的分子量选择合适的浓度,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径;
(7)分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。;4.凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关
分离蛋白质或核酸的分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)
蛋白质
?104 20-30
1-4×104 15-20
1-5×104-1×105 10-15
1×105 5-10
?5×105 2-5
核酸(RNA)
?104 15–20
104–105 5-10
105-2×106 2-2.6
;5.聚丙烯凝胶电泳的种类
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。
目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2),两者电泳原理完全相同。
;图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
(A为正面,B为剖面)
(1)样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7
(3)分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3
;图2夹心垂直板电泳槽及凝胶模示意图
;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的不连续体系
由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP(过硫酸铵)催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。
电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。;(1)样品浓缩效应
(a)凝胶孔径不连续性:
(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性;
在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子:HC1解离出的氯根(C1-)
尾随离子(trailingion)或慢离子:甘氨酸根
mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯根,P代表蛋白质,G代表甘氨酸根)有效迁移率=m?,m为迁移率,?
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