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腺相关病毒

引言

腺相关病毒（AAVs）是一种复制缺陷型细小病毒，其生产性感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。AAV

无辅助病毒系统（AAVHelper-FreeSystem）可以生产出无需辅助病毒的重组人血清型2型腺相关病毒

（AAV-2）。AAVHELPER-FREESYSTEM利用已经明确用于调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，

并且这些基因产物能通过转染引进宿主细胞。在AAVHELPER-FREESYSTEM中，生产具感染性的AAV

病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4和VARNA基因）大部分由和人AAV-2载体ＤＮＡ共转

染进细胞的pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提

供。本系统包括通过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的AAV-293细胞。通过消除对活的辅助

病毒的需求，AAVHelper-FreeSystem提供一个更安全，更纯净和更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基

因传递系统。

野生型AAV-2基因组由病毒rep和cap基因（分别编码复制和基因）及位于两侧的包含所有辅助和

包装必须的顺式作用元件的反向末端重复序列（ITRs）组成。在AAVHelper-FreeSystem中，rep和cap

基因从病毒载体中移除并转移到pAAV-RC质粒中，AAV-2ITRs仍位于病毒载体中。AAVrep和cap基因

的转移允许感兴趣的外源基因插入病毒基因组中。本系统可以容纳最大插入3kb。

在传统的基因传递系统中，有一个很大的顾虑是通过重组而恢复病毒野生型。在本系统中，包含AAV-2

末端重复序列的质粒(pAAV-MCS,pAAV-LacZ和pAAV-hrGFP以及pAAV-IRES-hrGFP)与包含rep/cap

基因的质粒(pAAV-RC)没有任何共同区域，从而阻止通过重组来野生型AAV-2。为了确保这种无共同区域

的保持，只用本系统提供的组件是非常重要的。特殊情况下，只能用pAAV-RC作为rep和cap基因的来

源和包含ITR的载体进行共转。

在AAV载体生产和AAV储存液滴度测定步骤中，AAVHelper-FreeSystem都消除了对野生型腺病

毒进行共感染的需求，使本系统成为彻底的无辅助病毒系统。而传统的AAV载体滴度测定时，需要野生型

腺病毒和AAV载体储存液进行共感染。由于细胞类型的不同，进行滴度测定时用腺病毒进行共转染的最佳

MOI值也是不同的，通常需要进行优化，这就导致了共转染进行滴度测定的方法变的复杂。在我们AAV

Helper-FreeSystem中独创了一个新颖的无腺病毒滴度测定方法，去除了对腺病毒进行共感染的需求，而

且得出同腺病毒共感染方法相同的结果。

重组腺相关病毒是基因传递和表达的一个重要工具。AAVHelper-FreeSystem具有广泛的宿主范围，

高滴度病毒生产能力和长期的基因转染潜力的特征。AAV具有广泛的细胞类型感染能力，并且不依赖于宿

主细胞活跃的分裂能力。另外，由于本系统不包含任何野生型病毒产品，宿主细胞免疫反应被降至最低，

从而允许对具有免疫能力的宿主细胞进行基因传递。对于哺乳动物细胞基因传递策略，高滴度的重组病毒

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生产能力是必须要顾及的。AAVHelper-FreeSystem可以生产出重组病毒滴度≥10病毒颗粒/毫升的病毒

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原液（浓缩后可以获得更高的滴度，文献报道浓缩后滴度最高可达≥10病毒颗粒/毫升。浓缩及纯化方法

见参考文献）。

AAV-2在复制许可的前提下具有复制到染色体上的能力，所以AAV-2在长期基因表达方面有特别重

要的价值。缓慢分裂期或非分裂期细胞可以长期保存AAV-2基因组于染色体上，并能稳定表达。高速分裂

期细胞在细胞复制和分裂后失去染色体上病毒基因