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基因工程制药

姓名：惠霞

学号：2011506024

班级：2011级生技1

班

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基因工程制药

一．基因工程制药常用的工具酶：

基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物

之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工

具酶。

(一)限制酶(Restrictionenzymes)

限制酶即限制性核酸切酶的简称，是一类专一性很强的核酸切酶。与一般的DNA水解酶不

同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。

限制酶的种类

Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。

Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因

子或只需Mg2＋。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其

识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。

(二)DNA聚合酶(DNApolymerase)

DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需

要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。

1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow片断

3.T4噬菌体DNA聚合酶

4.经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）

5.TaqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶

6.反转录酶

（三）DNA连接酶（DNAligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。

1.T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5羟基之间形成磷酸二酯键。

2.大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。

（四）基因工程中常用的其他酶

1.末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶）

2.T4噬菌体多核苷酸酶

3.核酸酶（Nuclease）

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4.碱性磷酸酯酶（Alkalinephosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA

分子中的5磷酸基（脱磷酸作用）。分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯

酶（CIP）。

二．基因工程制药中常用的克隆载体

载体：能在细胞进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,

又可称为分子载体或无性繁殖载体。基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、

λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。

（一）质粒

1.质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，

是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。

2常用的几种质粒载体

（1）pBR322及其衍生载体

pBR322最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含

有两个抗性基因（Tetr和Ampr），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。BamHI等

10个切点位于Tetr基因，PstI等6个切点位于Ampr基因组，EcoRI位点位于这两个基

因之间，有利于检出重组转化子。

PAT153载体：用限制酶HaeⅡ进行部分消化pBR322后再重新连接而获得，是不能被带

动的较小质粒载体（3.66kb），拷贝数比pBR322增加1.5～3倍。

pBR327载体：用EcoRⅡ部分酶切pBR322，去除非必需区段