高效茶树毛状根遗传转化方法.docxVIP

茶树遗传转化

1、菌株制备(1-4天)：

K599转化：将表达质粒转入K599菌株中，并涂板在含有链霉素(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的LB平板上28°。培养两天。

挑单克隆:单菌落接种于含有链霉素(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养液(1mL),28℃,200rpm,过夜。

小摇转大摇：将3mL的菌液转移到40mL含链霉素(50mg/L)和卡那霉素(50mg/L)的LB肉汤中，28℃,200rpm,培养至OD600=0.8-1.2。

A.rhizogenesactivationCulturedintubeCiilhirediiiflask

28℃,2d 280c.200rpm.1d28P.200rpni.1d

2、真空渗透(第5天)：

制备侵染液：离心机室温下5000rpm,离心10min收集细菌，将细菌悬浮于浸渗液(10mMMES,10mMMgCl2,200|1MAs,pH=5.2)中，调整浓度为OD600=0.8。将浸渗液放入200培养箱3-5h。

准备转化外植体：取茶树2-4节的分枝(0.5-1年生，长~105,直径~0.5cm),在基部斜切，获得用于遗传转化的分枝外植体。以茶树带叶柄(约6个月)的叶片为外植体进行遗传转化。

侵染:将枝叶外植体创面浸泡在浸润液中。将外植体与渗透液一起放入真空罐中，真空30mine侵染后的外植体在无菌蟀石中24±2℃,16h光/8h暗光周期，高湿度环境中培养。

InductionilldarkRT.3-5bExplainspreparationRT.30minVacuuminfiltrationRT.30min

InductionilldarkRT.3-5b

ExplainspreparationRT.30min

Vacuuminfiltration

RT.30min

Incubationinvermiculite

24℃.40(1

3、转基因毛状根验证(第6-60天)：

典型的毛状根形成大约在转化后35-50天开始。

转基因毛状根可以用通过转化质粒上的标签识别，比如GFP通过荧光荧光可视化闪光灯(luyer?3280)识别；GUS通过GUS染色法识别。

遗传转化效率的计算公式如下:(含有阳性根的外植体数量)/(外植体总数)]x100%o

通过常规PCR扩增和共聚焦观察进一步确认gfp阳性根。

Transformantsverification

RT.30min

4、转基因毛状根愈伤组织诱导

准备超净工作台，取阳性转基因毛状根用无菌水冲洗，然后在含遗传霉素G418（100mg/L）和头抱cef（400mg/L）的无菌水中浸泡一夜。

第二天，将发状的根从树枝上剪下来，放在干净的工作台上的无菌滤纸上晾干水分。将根转移至20%次氯酸钠溶液中消毒2-3min,将消毒后的根转移至消毒水中浸泡5min,用无菌滤纸将根表面干燥，然后用消毒刀片将根切成l-2cm,置于MS固体培养基（0.2mg/LNAA,4mg/L6-BA,lOOmg/LG418,400mg/Lcef）上。在26/22℃,16h光/8h暗的条件下培养。

MS固体培养基每2周更换一次，以确保抗生素和激素的有效性。

OW 4W6W10W I4W 18W 22W 26W WT

OW 4W

6W

10W I4W 18W 22W 26W WT

培养基配置

LB平板（K599菌株）：LB营养琼脂按说明比例配置后，高压灭菌15min,待冷却至55℃左右时，在超净台中按照培养基体积加入相应比例的链霉素（50mg/ml）和卡那霉素（50mg/ml）的抗生素工作液，倒板。

LB液体培养基（K599菌株）：LB肉汤按说明比例配置后，121℃高压灭菌15min,待冷却至55c左右时，在超净台中按照培养基体积加入相应比例的链霉素（50mg/ml）和卡那霉素（50mg/ml）的抗生素工作液。

浸渗液：按lOmMMES（MES钠盐）,10mMMgCI2,200|1MAs（乙酰丁香酮）的浓度添加相应物质溶于无菌水，调整pH二为5.2。

诱导愈伤培养基：按比例配制MS培养基（不含琼脂和蔗糖）4.74g/L+琼脂6.5g/L+蔗糖30g/L+0.2mg/LNAA+4mg/L6-BA,121℃高压灭菌20min,待冷却至55c左右时，在超净台中按lOOmg/LG418+400mg/Lcef浓度力口入抗生素，倒板。