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核酸的提取与纯化

一DNA的提取与纯化

（一）实验目的与要紧原理

DNA存在于细胞核中。通过裂解组织与细胞，使细胞膜破碎，

暴露出DNA与蛋白质的混合物。现在，通过蛋白酶的消化，使

DNA与蛋白质进行分离，而后利用硅胶柱或酚：氯仿法，去除

蛋白质，从而提取高纯度DNA。

（二）实验材料

蛋白质K（20mg/ml）,裂解液（100mmol/lTris(pH,500mmol/L

EDTA(pH,20mmol/lNaCl,10%SDS）,硅胶柱，TE（10mmol/l

Tris-HCl,1mmol/LEDTA(pH,*TAE(20mmol/lTris-乙酸，l

EDTA,pH,10*Loadingbuffer(50mmol/lEDTA,60%甘油，%溴酚

蓝，pH。

（三）实验方式

DNA提取的方式目前要紧有两种，一种是利用酚：氯仿抽提

的方式，另一种是利用硅胶柱吸附的方式。其中酚：氯仿抽提法由于

试剂具有较强的侵蚀性和毒性，且对环境污染较大,目前利用者较少。

而硅胶柱的方式操作比较简单，且毒性很低，对环境的阻碍较少，故

而被广大实验者所利用。目前硅胶柱的生产厂家较多，以沉淀方式较

为多见，要紧步骤如下。

1样本前处置

哺乳动物细胞：提早预备55℃冰浴。

（1）关于贴壁细胞，用胰蛋白酶或其他方式搜集细胞，关于悬

浮细胞，直接搜集细胞。用PBS洗3次。

（2）加入3倍体积的裂解液，加入蛋白液K终浓度达到

500ug/ml，37℃孵育4~6小时。

动物组织：提早预备55℃，70℃水浴。

（1）将25mg动物组织切碎，置于一无菌的离心管中（注意，

尽可能越碎越好）。

（2）加入150~200ul的裂解液（含500ug/ml的蛋白酶K），55℃

孵育直至完全裂解，（因组织不同而异，鼠尾6~8h,能够

留宿裂解，每小时倒置2~3次）。

（3）若是需要去除RNA，能够加入适量RnaseA于样品中，室

温孵育2min。

（4）12000r离心5min，转移上清于一无菌的离心管。

2DNA提取进程

（1）利用2倍体积无水乙醇和1/10体积的3mmol/L醋酸钠沉

淀DNA（注意沉淀为DNA，不能弃去）

（2）将上述混合物加入硅胶柱中，12000r离心1min，后用75%

的乙醇清洗杂质，洗2~3次。

（3）将硅胶吸附柱置于干净的离心管中，在柱的中央加入

200ul预热TE（60℃），或去离子水（pH）），室温静置1min，

12000r离心1min，洗脱ＤＮＡ。洗脱出的ＤＮＡ置于－

２０℃保留。

3琼脂糖凝胶电泳

（1）1%琼脂糖的配制：例如：琼脂糖+15ml*TAE微波炉

加热至沸腾，待降低至70℃加入Goldview染料

（5ug/100ml），倒入小型胶槽中（其他规模胶槽按此

比例配制）。室温静置40min。

（2）取50~100ngDNA,用去离子水补充体积至10ul，加入

1ul10*DNAloadingBuffer，进行电泳。电泳120V

20~30min（电泳液5*TAE）

（四）注意事项

1裂解液与样品的比例要适当，过少的裂解液可能致使样

本裂解不完全，而过量的裂解液也会阻碍提取成效。

2尽可能切碎组织，以免阻碍裂解成效；完全裂解后能够