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胶内酶解质谱样品前处理-蛋白考染胶
溶液配制:
1、水:HPLC级;乙腈:HPLC级;乙醇:HPLC级;
2、200mMNH4HCO3溶液:取NHHCO加水溶解并稀释到50ml。稀释4倍得到50mMNH4HCO3
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溶液,稀释8倍得到25mMNH4HCO3溶液;
3、25mMNH4HCO3的50%的乙醇-水溶液(考染脱色液):50%乙醇-水溶液和50mMNH4HCO3
溶液等比例混匀;
4、10%乙酸的50%乙醇-水溶液;
5、DTT溶液:10mMDTT的25mMNH4HCO3溶液(ml,现配此浓度,-20℃保存须两天内用
完);
6、IAA溶液:55mMIAA的25mMNH4HCO3溶液(mg/ml,现配此浓度,避光保存,-20℃
保存须两天内用完);
7、Trypsin溶液:取储存于-80℃的分装浓缩酶溶液(浓度为100ng/ul(20ug到200ul),
溶于50mMNH4HCO3溶液中),用50mMNH4HCO3溶液稀释为10ng/ul,全程冰上操作;
8、50%乙腈-水溶液(含5%三氟乙酸);
9、75%乙腈-水溶液(含%三氟乙酸);
10、%三氟乙酸-水溶液;
11、50%乙腈-水溶液(含%三氟乙酸)。
12、避光新鲜配置脱色液(银染):50mMNaS2O3:15mMK3Fe(CN)=1:1混合
取胶
3
1.用超纯水清洗胶块2次,用手术刀片切下胶上目标条带,用手术刀片充分切碎(1mm
大小,用HPLC级异丙醇和水分别洗涤手术刀和镊子)。
第一天:
考马斯亮蓝染色凝胶的脱色
2.把切碎的胶块置于管中(预先加入1ml考染脱色液,含25mMNH4HCO3的50%的乙醇-
水溶液),室温震荡15-20min(在混匀仪中高速震荡混匀),重复2-3次,直至胶块
无色,14000rpm离心1min,去上清。
3.加入1ml10%乙酸的50%乙醇-水溶液在恒温混匀仪上室温震荡洗涤胶块2次,每次30
分钟,去上清。
4.加入1ml水,在恒温混匀仪上室温轻微震荡洗涤胶块胶块2次,每次5-10分钟,去上
清。
5.加乙腈1ml漩涡混合洗5min,弃液,真空抽干10min(1308室Christ冻干仪,使用浓
缩功能,下同)。
Destain银染凝胶的脱色
1.加500μl脱色液,室温避光震荡5~10min,14000rpm离心1min,弃去溶液,重复1~
2次至胶块去除银染颜色。
2.加500μl50mMNH4HCO3,震荡5~10min,14000rpm离心1min,弃去溶液,重复
1~2次至溶液无明显黄色。再加500μl50%乙腈,震荡5~10min,14000rpm
离心1min,弃去溶液。
3.加500μl50mMNH4HCO3,震荡5~10min,14000rpm离心1min,弃去溶液。再加
1ml50%乙腈,震荡5~10min,14000rpm离心1min,弃去溶液,至胶块呈白色。
5.加乙腈1ml漩涡混合洗5min,弃液,真空抽干10min(1308室Christ冻干仪,使用浓
缩功能,下同)。
还原烷基化
5.加入30-60ul(可适当多加,没过胶条)DTT溶液,56℃恒温混匀仪上震荡孵化1
小时,冷却至室温,离心去上清,真空抽干10min。
6.加入30-60ulIAA溶液(体积与DTT大体相同),暗处室温孵育45min,去上清。
7.加1ml50mMNHHCO溶液震荡洗胶块10min,14000rpm离心1min,去上清。
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8.加1ml水震荡洗胶块10min,14000rpm离心1min,去上清。
9.加乙腈1ml漩涡混合洗5min,14000rpm离心1min,去上清,真空抽干10min。
酶解
10.把胶粒转移至的离心管中,加入25~35ulTrypsin
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