副猪格拉菌微量凝集抗体检测操作规程.pdfVIP

副猪格拉菌微量凝集抗体检测操作规程

1范围

本文件确定了副猪格拉菌微量凝集抗体检测的操作规程。

本文件适用于副猪格拉菌的快速检测、诊断、监测和流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

HPS：副猪格拉菌（Haemophilusparasuis）

MAT：微量凝集抗体检测试验（micro-agglutinationtest）

5试剂与材料

5.1除非另有规定，仅使用分析纯试剂。所用液体试剂均需按照说明进行配制。

5.2水：GB/T6682，一级。

5.3PBS溶液：称取磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g、氯化钾0.2g，加灭菌水约

800mL充分搅拌溶解，加入盐酸调pH值至7.2，定容至1000mL。

5.4阳性血清：由标准血清型5型菌株制备的疫苗免疫新西兰大白兔后制备的强免血清。

5.5阴性血清：在无特定病原的SPF兔上采集的血液制备的血清。

1

5.6培养基：胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）为市售培养基，配制方法按照

说明书进行。

5.7生理盐水：100mL水中加0.85gNaCl，121℃高压30min后置于4℃使用。

5.8甲醛：商品市售试剂。

6仪器设备

6.1紫外分光光度计

6.2恒温恒湿培养箱：0℃-65℃、±1.0℃；不均匀度±1.5℃。

6.3分析天平：精度为0.001g。

6.4离心机：转速不低于13,000r/min。

6.5冰箱：2℃~8℃和-20℃以下。

6.6酸度计。

6.7电热恒温水槽：室温至100℃，温度精度±0.5℃。

6.8涡旋振荡器。

6.9微量移液器：10μL、20μL、100μL、1000μL。

6.10离心管：1.5mL、10mL、50mL；无菌。

7实验步骤

7.1样品采集、保存、运输和处理

7.1.1总则

符合GB19489和NY/T541中关于实验室生物安全和兽医诊断样品的采集、保存与运输的要求。

7.1.2血液样品采集

按照NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范确定的规程，无菌采集病死猪的血液，置

于含有适量抗凝剂的采集管内，反复颠倒采血管，使抗凝剂与血液充分混匀。

7.1.3样品保存和运输

在2℃~8℃保存宜不超过24h，-20℃以下不超过3个月，-70℃以下不超过10年。

7.1.4样品处理

将采集的血液以2000r/min~3000r/min离心10min（血样采集后室温放置1h之内进行离心；血样采

集后冰上放置可以在4h内进行处理），上清液即为血清。

2

7.2抗原制备

7.2.1取血清5型冻干菌株，加入2.0ml灭菌生理盐水溶解，划线接种于TSA培养基，于恒温培养箱

中5％CO、37℃培养48小时。

2

7.2.2分别挑取多个典型菌落密集划线接种于TSA培养基，置于5％CO、37℃恒温培养箱中培养

2

12h～16h后，用灭菌生理盐水分别洗下菌苔，用紫外分光光度计测定OD600，用灭菌生理盐水适量稀

9

释，根据OD600值与活菌数的相关性曲线，调节菌株OD600值，使菌株的活菌量约为3.0×l0CFU/ml