猪星状病毒五型荧光PCR检测方法.pdf

猪星状病毒五型荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定了猪星状病毒五型病的临床诊断和实验室诊断方法。临床诊断方法包括流行病学特点、

临床症状和病理变化；实验室诊断方法为病原学检测，包括病毒分离与鉴定、TaqMan荧光定量PCR检

测方法。

本标准适用于对猪星状病毒五型病的诊断及流行病学调查等，可用于不同样品中的猪星状病毒五型

病的病毒检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

猪星状病毒五型Porcineastrovirus5，PAstV5

一种可以引发猪病毒性腹泻的单股正链RNA病毒。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PAstV5：猪星状病毒五型

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应

TaqManqPCR：TaqMan荧光定量聚合酶链式反应

5临床诊断

5.1流行病学

PAstV5广泛流行于我国猪群中，常和其他猪肠道病原混合感染引起腹泻，给我国养猪业带来了严

重的经济损失。PAstV5自发现以来一直是我国PAstV流行的主要基因型（总阳性占比为31.9%，

251/786），在2019年~2021年间，其阳性率达到35.2%（185/526）。此外，PAstV5与数种常见猪肠道

病原，包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪捷申病毒（PTV）、猪轮状病毒（PRoV）、猪德尔塔冠状

病毒（PDCoV）等混合感染造成其临床检测难度加大。

1

5.2临床症状

PAstV5是一种可引起仔猪腹泻的肠道传染病病毒，主要导致仔猪出现呕吐、腹泻及脱水，仔猪生

长迟缓等症状。患病猪出现上述临床症状时，可作为综合诊断的判断标准之一。

5.3病理变化

小肠上皮细胞局部坏死，绒毛轻微萎缩或脱落。

5.4结果判定

易感动物符合5.1且出现5.2临床症状、5.3病理变化时，可以初步判定为PAstV5疑似病例，确诊需

要实验室诊断。

6样品的采集与处理

6.1样品采集

6.1.1组织样品

用无菌剪刀剪取发病仔猪的小肠组织0.5g~1.0g组织作为待检样品，置于离心管。

6.1.2粪便及肠内容物样品

用无菌的药匙，刮取新鲜粪便及肠内容物，放置于离心管。

6.2样品处理

6.2.1组织样品

采集的肠组织（经剪碎处理），按1:5的比例加入DMEM细胞培养液，反复研磨至糊状，将研磨好

的病料反复冻融3次，4℃3000rpm离心20min，上清液用0.22μm微孔滤器过滤，收集样品滤液。

6.2.2粪便及肠内容物样品

采集的粪便或肠内容物，按1:5的比例加入DMEM细胞培养液，震荡混匀，4℃3000rpm离心20

min，上清液用0.22μm微孔滤器过滤，收集样品滤液。

6.3存放与运输

采集的样品与冰块或干冰一起放入保温箱，密封，在保温箱外喷洒消毒液，立即送到实验室检测。

处理后样品在4℃~8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置于-80℃冰箱，避免反复冻融。

7实验室鉴定

7.1病毒的分离与鉴定

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7.1.1主要仪器和设备

生物安全柜、恒温CO2培养箱、倒置显微镜、台式低温高速离心机、组织研磨器、微孔滤器（滤

膜孔径0.22μm）、可调微量移液器（2μL-20μL、20μL-200μL、100μL-1000μL）、细胞培养板（6

2

孔、96孔）、细胞培养瓶（25cm）、高压蒸汽灭菌锅、离心管（1.5mL、2mL）、冰