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核酸提取方法的技术要点和注意事项

一、核酸的基本概念核酸是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）

的总称，是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物，为生命的

最基本物质之一。一个核苷酸分子是由一分子含氮的碱基、一分子五

碳糖和一分子磷酸组成的。根据五碳糖的不同可以将核酸分为脱氧核

糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。

核酸都是极性化合物，都溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂。在

酸性溶液中易水解，在中性及弱碱性溶液中稳定性稍高。

二、核酸提取前样本采集、预处理和保存全血：抗凝剂EDTA或枸橼

酸钠，不宜使用肝素

（抑制Taq活性）；血清和血浆：主要用于检测病毒、细菌和肿瘤细

胞等释放入血的游离核酸；分泌物：痰液是检测呼吸道病原体核酸的

主要样本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前应先

漱口，以避免混入大量口腔脱落的上皮细胞和唾液影响检测结果。

三、核酸提取的基本步骤及使用试剂

1.核酸的释放；2.核酸的分离与纯化；3.核酸的浓缩、沉淀与洗涤。

核酸提取的常用组分

成分名称原理及作用

酚蛋白质的变性剂，可抑制DNase的降解作用

SDS（十二烷基磺亲水基表面活性剂，可破坏细胞膜、核膜、并

使组织蛋白酸钠）与DNA分离溶解脂类蛋白

TritonX-100非离子表面活性剂，有助于蛋白质与DNA分离

异硫氰酸胍变性裂解细胞，强有力的蛋白质变性剂，能迅速

溶解蛋白质，导致细胞结构破坏

4-羟乙基哌嗪一种重要的氢离子缓冲剂,能较长时间控制恒定

乙的pH

磺酸(HEPES)

异丙醇

DNA在冷乙醇或异丙醇中沉淀，因为DNA在醇中

不可溶而黏在一起，这一步也能除掉盐分

氯化钠

氯化钠溶液中DNA的溶解度最低，而蛋白质高，

可以去除蛋白；抑制核酸酶在裂解过程中对核酸

的破坏，维持核酸的稳定等

矿物油去除非核酸有机杂质

磁珠吸附核酸

四、实验室常用核酸提取技术

1.酚/氯仿抽提法/醇沉淀法；2.层析柱法；3.煮沸裂解法；4.一步

法；5.纳米磁珠法。

1.酚/氯仿抽提法/醇沉淀法：酚是蛋白质的变性剂，同时抑制了

DNase的降解作用，SDS（十二烷基磺酸钠）将细胞膜裂解，在蛋白酶

K、EDTA的存在下消化蛋白质，核蛋白变性降解，使核酸释放。核酸

易溶于水，不溶于有机溶剂，蛋白质本身带有亲水基团，但当有机溶

剂存在时，蛋白质变性沉淀。利用离心后有机溶剂位于底层（脂质），

核酸存在水相层，蛋白质则沉淀于两相之间的原理分离核酸。

2.层析柱法：提DNA时：通过特殊硅基质吸附材料，能够特定吸附

DNA，而RNA和蛋白质顺利通过，然后利用高盐低PH结合核酸，低盐

高PH值洗脱，来分离纯化DNA。提RNA时：提取使用到的离心管壁多

是聚丙烯的材料，管壁上有静电，会吸附核酸。carrierRNA减少了目

标核酸物质的管壁吸附损失，进而提高微量的核酸纯化柱上的结合和

洗脱效率，同时降低了提取环境中的RNase降解微量RNA的概率。注

意：可以进行核酸的纯化核浓缩，不适用大批量样本，对人员操作要

求高。

3.煮沸裂解法：加入Tris等使细胞膜破裂，在用高温使细胞完全裂

解，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性，再使用有机溶剂抽提使

核酸分离并进行沉淀。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA，

回收上清液中的目的DNA。注意：需要金属浴，有爆盖风险，不能

用于RNA。

4.一步法：首先核酸释放剂快速裂解、释放病毒核酸，然后加入待

测样本，与释放剂充分混匀，静置一段时间后，加入扩增试剂上

机扩增。注意：要求试剂盒的抗干扰能力高。

5.纳米磁珠法：磁珠表面连接了可特异地与核酸发生作用的功能基

团，具有可逆吸附核酸的特性，通常采用带有氨基、巯基、环氧

基等基团的活化试剂对磁珠表面包覆的高分子进行化学修饰。也