拟南芥m iR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的 转化.pdf

拟南芥miR395d基因的克隆和过

拟南芥miR395d基因的克隆和过

表达载体构建及其在油菜中的

表达载体构建及其在油菜中的

转化

转化

引言

•miRNAs是一类内生、非编码蛋白长度约为21--

24个核苷酸的单链小分子RNA，在生物体内起

着基因转录后的调控作用。

•成熟的miRNA先于一种叫RISC的复合物接合，

引起靶mRNA的降解；而当mRNA与靶mRNA不

完全互补时，mRNA则通过与对应的靶mRNA的

3’端非翻译区（3’UTR）结合阻止其转录后的翻

译。

•植物中的miRNA与其靶mRNA具有高度的碱基

互补性，因而植物miRNA可能更像sRNA的作用

方式对靶基因进行降解。

引言

•作为重要的调解分子，miRNA参与生命过程中一

系列的重要进程，包括生长发育、信号转导、病毒

防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂

肪代谢、肿瘤发生等。

•也有一些研究报告指出，miRNA在调解植物对环

境胁迫如干旱、盐害和养分胁迫反应等方面起着重

要的作用。

引言

•油菜作为一种重要的油料和经济作物，在硫的吸

收、转运及代谢中同样需要硫转运体和ATP硫酸

化酶的协助。

•本实验采用PCR方法从拟南芥中克隆到了mR395d

前体基因，并构建了过表达载体，通过采用根癌

农杆菌介导法将mR395d前体基因导入甘蓝型油菜

特选4号中，目前已获得了转基因植株。

一、材料与方法

１.材料

拟南芥，甘蓝型油菜品种特选4号，大肠杆菌DH5A，农杆

菌菌种EHA105，表达载体质粒pCAMBIA1304。rTaq酶,

dNTP,限制性内切酶。

２.方法

１）拟南芥DNA的提取

用CTAB法[13]从幼嫩的拟南芥叶片中提取DNA。

２）拟南芥miR395d前体基因的克隆

参照拟南芥miR395d前体基因序列设计引物,为了便m

iR395d过表达载体的构建,在上游引物的5端加入BglÒ酶

切位点,下游引物5端加入了SpeÑ酶切位点,以拟南芥

DNA为模板,PCR扩增466bp左右的miR395d前体基因。

材料与方法

３）PCR产物的回收与测序

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收后与克隆载

体pMD19TVector连接,转化大肠杆菌DH5A感受态细胞,

在含有IPTG、X-gal和Amp的LB平板上挑选单克隆。

其中：ＩＰＴＧ——

Ｘ－ｇａｌ

Ａｍｐ

ＬＢ

材料与方法

４）拟南芥miR395d前体基因过表达载体构建

用限制性内切酶BglÒ和SpeÑpCAMBIA1304和pre-m

iR395d分别进行双酶切,酶切产物进行凝胶电泳后回收,

将回收产物用T4DNA连接酶连接,16摄氏度过夜,得到过

表达载体,命名为pCAMBIA1304-miR395d,对重组子进

行PCR和序列测定。

过表达载体构建的原理和步骤：

原理：将外源基因片段与载体连接（载体通常选用质粒或者

噬菌体或其他病毒），将重组的载体转染受体细胞，使之

整合入宿主基因组或者在稳定存在于胞质内，是宿主细胞

能够表达载体上的外源基因，从而获得新性状或者新产物。

步骤：

1）从基因组或cDNA上克隆得到完整的目的基因（至少包含

CDS区），通常在两端加粘性末端或重组位点；

2）选择合适的表达载体（真核、原核、噬菌体、某些病毒、

标记等）；

3）将克隆得到的目的基因与载体连接；

4）将重组载体通过某种手段转入受体，即宿主中（化学转

染、脂质体、电转、显微操作等）；

5）筛选阳性的宿主细胞并扩繁。

材料与方法

５）根癌农杆菌介导法转化油菜

无菌苗培养:

选取籽粒饱满的油菜种子用70%乙醇表面消毒30s,再用1

克每升HgCl消毒5min,无菌水冲洗5次,接种于种子萌

2

发培养基(MS)上,置25。Ｃ光照培养箱中,每天