脐血干细胞分化与应用.ppt

LygaseClosedCircleCohesiveEndsLinearDoubleStrandedOpenedCircle第25页,共32页，星期六，2024年，5月血管新生是当前医学与生物学研究的热点,治疗性血管新生在心脏血管与外周血管狭窄的动物实验中有很好的效果,并且已在数百例心与外周动脉缺血患者进行了临床一、二期试验治疗,取得了一定的成绩。但由于对人有效灌注所需的管腔面积要比实验动物大得多,因此取得理想治疗效果要困难得多。一些重要的问题尚待进一步解决:①确定合适的剂量以及更合理地联合运用多种诱导因子?②延长转染的基因在体内的表达时间?③是否有使机体其他部位不该增生的血管增生的危险?治疗性血管新生为心与外周血管疾病的防治开辟了一个新的途径,并可能特别适用于那些不能用药物、介入和/或手术治疗,或治疗效果不好的患者。此外,这种新的治疗方法也可促进创伤愈合与手术伤口愈合,将有广泛的应用前景。第26页,共32页，星期六，2024年，5月血管内皮生长因子(VEGF)是一种内皮细胞专一性丝裂原和血管新生强烈的刺激因子。内皮细胞表面的两个酪氨酸激酶受体Flt-1与Flt-1/KDR与VEGF结合后,传导相应的增殖与迁移信号,使内皮细胞增殖,形成新的毛细血管并重构与稳定。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其受体FGR2,血管生长素1(Ang-1)及其受体Tie-1与Tie-2,胎盘生长因子(PlGF),肝细胞生长因子(HGF),血管生成素(angiogenin)、血小板衍生生长因子(PDGF)与环氧化酶-2也是重要的促血管新生因子。这些因子相互协同,并且在细胞分化的不同阶段发挥不同的作用。VEGF在血管新生的起始与维持阶段都有作用,bFGF主要参与初期过程,而Ang-1、PlGF与PDGF主要影响血管的成熟与稳定。第27页,共32页，星期六，2024年，5月Ficoll密度梯度离心法得脐血单个核细胞MACS法脐血CD34+单个核细胞分离细胞培养:将分离所得CD34+和CD34-单个核细胞分别接种于60mm培养皿中,加入M-199培养基,20%FCS、牛脑提取物作为内皮细胞生长补充,抗生素、生长因子VEGF30ng和bFGF24ng,于37℃,5%CO2饱和湿度的孵箱中培养。培养3、7、14d,显微镜下观察细胞形态和细胞簇形成的情况。试验中细胞的诱导分化主要采用生长因子为VEGF和bFGF。bFGF可引起内皮细胞的增生和移行,且还可以与VEGF协同作用,在体外促使内皮细胞分裂成毛细血管样结构,在体内产生血管新生。VEGF是血管内皮细胞的有丝分裂原，还能抑制CD34+前驱细胞中树突状细胞的成熟。VEGF和bFGF的组合在体外明显促进内皮系细胞的生长和分化,内皮系细胞具有优势性地生长。第28页,共32页，星期六，2024年，5月刚分离的CD34+和CD34-单个核细胞呈圆形,细胞形态小,不均匀地悬浮分布于培养皿底部CD34+细胞培养48h后可见细胞贴壁,3d后有明显集落形成7d后大量梭形细胞从细胞簇周围开始生长。梭形的细胞出现典型的线样排列结构,相邻的细胞簇之间相互连接形成血管网样结构CD34-单个核细胞单独培养,可见部分贴壁细胞,大部分细胞呈悬浮状,且贴壁细胞主要为圆形,随着培养时间的增加细胞形态逐渐变大,呈现出不规则形态第29页,共32页，星期六，2024年，5月内皮特异性成分蛋白水平的鉴定CD34+细胞培养14d后在细胞膜和细胞浆中都有弥漫性棕色出现,呈现出阳性反应。证实了有内皮细胞特异性成分ecNOS和flk21(KDR)蛋白水平的表达第30页,共32页，星期六，2024年，5月脐血分离的CD34+细胞培养前后祖细胞标志物CD34+随着细胞的成熟表达水平下降,而内皮细胞的标志物CD31明显升高(P0.05)。说明祖细胞诱导培养后的贴壁细胞具有内皮型标志物。PE-CD34抗体(鼠抗人)和同型对照鼠IgG1抗体(Diaclone);FITC-CD31抗体(鼠抗人)和同型对照鼠IgG1抗体第31页,共32页，星期六，2024年，5月感谢大家观看第32页,共32页，星期六，2024年，5月关于脐血干细胞分化与应用“干细胞”的概念在数十年前就已有介绍，但是直到目前，仍然还无法从形态或表型界定干细胞，而只能根据其功能定义。干细胞具有两种特定的功能。增殖功能指干细胞具有自我更新能力，可以生成更多的干细胞；分化功能则指干细胞能分化成为各种祖细胞，后者可