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补体介导的细胞毒试验
实验原理
带有特异抗原的靶细胞与相应抗体结合
染料可通过细胞膜进入细胞内使细胞着色，故可用于指示死细胞或濒死细胞，而活细胞不着色。
在补体的参与下，引起靶细胞膜损伤，导致细胞膜的通透性增加、细胞死亡
观察实验结果
试验材料的选择
抗原抗体的选择
补体的选择
试剂中补体含量丰富、浓度大，从而可以快速、充分介导细胞毒过程
补体取材尽量容易
抗原、抗体可以特异性结合
细胞表面含有丰富抗原
抗原、抗体取材尽量容易
抗原、抗体的选择
本实验中选择cd57小鼠胸腺淋巴细胞表面抗原Thy-1作为实验抗原、抗小鼠Thy-1的单克隆抗体作为实验抗体。
抗原、抗体
Thy-1抗原是最早在胸腺淋巴细胞和T细胞中发现的分化抗原之一。它首次是从小鼠体内被鉴定出来的，它在小鼠和大鼠胸腺细胞表面含量极为丰富，而且现在已经研制出可以和它特异性结合的单克隆抗体并投入生产。
补体的选择
本实验中选择豚鼠补体作为实验补体各种实验动物中以豚鼠血清的补体成分含量最为丰富，溶血能力较强，又较容易获得。豚鼠补体也符合上述选择补体的依据。
实验思路流程图
实验材料的选择
补体
抗体
抗原
实验具体操作过程
√
补体的制备
补体的制备
凝血
豚鼠心脏取血
羊血混匀吸收
制得补体
2005
2006
2007
视频later
实验思路流程图
实验材料的选择
补体
抗体
抗原
实验具体操作过程
胸腺细胞悬液
的制备
补体的制备
√
小鼠胸腺细胞悬液的制备
谨防小鼠回头咬伤手指
1、胸腺位于胸骨与肺之间
2、应始终浸入Hank‘s液操作
用hank’s液洗涤两次
在整个操作中胸腺细胞制备速度要快，切忌将细胞暴露在空气中太久
颈椎脱臼法处死
研磨胸腺组织、
过筛
离心、洗涤
重悬于hank’s液
细胞悬液的制备
视频later
实验思路流程图
实验材料的选择
补体
抗体
抗原
补体介导
细胞毒作用
胸腺细胞悬液
的制备
补体的制备
实验具体操作过程
√
补体介导的细胞毒过程
试验材料
试验管
补体对照管
细胞对照管
1X107／ml胸腺细胞悬液
0.1ml
0.1
0.1
Thy-1单克隆抗体
0.1ml
——
——
Hanks液
——
0.1
0.2
1:3补体
0.1ml
0.1
——
视频
补体介导的细胞毒试验
补体
抗体
抗原
染色观察
细胞毒作用结果
补体介导
细胞毒作用
胸腺细胞悬液
的制备
补体的制备
实验材料的选择
实验具体操作过程
√
细胞染色及观察
1、滴加适量，1滴
2、室温放置2分钟
细胞对照管死细胞数若超过5％，实验需重新做。正常值应小于2%。
加入伊红-Y染液染色
高倍镜下观察
实验思路流程图
补体
抗体
抗原
染色观察
细胞毒作用结果
补体介导
细胞毒作用
胸腺细胞悬液
的制备
补体的制备
实验材料的选择
实验具体操作过程
记录死细胞百分数（补体活性）
√
实验结果及分析
试验管
补体对照管
细胞对照管
所数细胞数目
267
250
250
死细胞数目
250
0
0
死细胞百分比
93.6%
0
0
本实验中死细胞百分数=（93.6%-0.0%）/(100%-0.0%)=93.6%
本实验结果与预期基本相同：试验管中，抗原抗体相结合激活补体途径造成细胞穿孔，从而导致死细胞百分比达到93.6%。
视频first
实验思路流程图
补体
抗体
抗原
染色观察
细胞毒作用结果
补体介导
细胞毒作用
胸腺细胞悬液
的制备
补体的制备
试验方法的探讨与改良
实验材料的选择
实验具体操作过程
记录死细胞百分数（补体活性）
√
实验方法的探讨与改良
MTT法
硫化罗丹明法（SRB)
形态计数法
MTT法：判断出细胞整体活性情况，无放射性
SRB法：最灵敏、准确、快速
形态计数法：仅判断局部细胞活性，简便（本实验）
测定细胞活性
二、测定细胞活性方法选择的探讨
实际应用
补体介导的细胞毒试验（又名淋巴细胞毒交叉试验），这个试验最基本的应用在于检查细胞膜抗原及抗体的特异性：在器官移植前检查器官移植受者体内有无针对供者,或者供者针对受者的HLA抗体。本实验在临床上广泛应用于与移植有关的抗原-抗体特异性检查，有重要的意义。
参考文献
1.曹柳英,梁瑞燕,潘华新,周联.制备豚鼠补体时避免溶血发生的方法学探讨[J].广州中医药大学学报,2005,(04)
2.郭莉霞,侯青青.细胞活性测定方法研究进展[J].重庆工商大学学报(自然科学版),2006,(06)
3.曹柳英,梁瑞燕,潘华新,周联.制备豚鼠补体时避免溶血发生的方法学探讨[J].广州中医药大学学报,2005,(04)
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