《胡椒瘟病病原物分子检测技术规程》.pdf

胡椒瘟病病原物分子检测技术规程

1范围

本标准规定了胡椒瘟病病原菌（Phytophtoracapsici）的术语和定义、检测方法、结果判定、结

果记录、样品保存。

标准适用于胡椒瘟病病原菌的分子检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

NY∕T3816-2020热带作物病虫害监测技术规程胡椒瘟病

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

胡椒瘟病pepperPhytophthorafootrot

由辣椒疫霉（Phytophthoracapsici）引起的胡椒卵菌病害，又称胡椒基腐病。

4检测方法

原理

根据胡椒瘟病病原菌三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白基因(Ypt1)保守区域设计特异性引物进行PCR扩增。

依据是否扩增获得预期230bp的DNA片段，判断样品中是否携带胡椒瘟病病原菌。

主要器材

4.2.1主要仪器

手持式组织研磨器、台式离心机、PCR检测仪、电泳仪、凝胶成像仪等

4.2.2主要器具和耗材

剪刀、镊子、样品密封容器、1.5ml离心管、一次性研磨杵、移液器、吸头、PCR管等，其中接触

样品的器材应是洁净无菌的。

4.2.3主要试剂及配制方法

1

除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯。

4.2.3.1DNA提取缓冲液

在900mL去水中加入1.46g氯化钠、2.42g三羟甲基氨基甲烷（Tris）、20g聚乙烯吡咯烷酮

（PVP-40）、0.73g乙二胺四乙酸（EDTA）、0.5g十二烷基硫酸钠(SDS)，用1mol/L盐酸调整pH

至8.0，定容至1000mL。室温保存。

4.2.3.2PCR反应液

用PCR预混试剂、引物、样品DNA等配制，或者用耐热DNA聚合酶、PCR缓冲液、氯化镁、dNTPs、引

物、样品DNA等配制。方法参照PCR产品说明书。现配现用。

操作步骤

4.3.1样品采集

按照NY∕T3816-2020进行田间诊断，选择带有疑似症状植株的病健交界部位，采集长度为5cm～

10cm的主蔓或叶片。样品应放入密闭容器内，室温存放时间不宜超过48h，长期保存应置于-70℃及

以下温度环境。将取样结果进行记录，记录表格见附录A。

4.3.2样本DNA制备

4.3.2.1待检样本DNA制备

取30mg～50mg病健交界处组织，剪碎后放入1.5ml的离心管中。加入500μlDNA提取缓冲液，

用手持式组织研磨器研磨成匀浆。10000×g离心2min，将上清液转移至新的1.5ml离心管中，即为DNA

模板。冷藏贮存不宜超过3h，长期保存应在热处理（80℃，5min）后置于-20℃及以下温度环境。

4.3.2.2对照样本DNA制备

以人工接种发病的胡椒叶片为阳性对照、以健康叶片为阴性对照。DNA制备方法同4.3.2.1.

4.3.3PCR反应

配制25μLPCR反应液，其中DNA模板、上游引物和下游引物添加量均为1μL。检测用特异引物序

列及使用方法见表1。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec,55℃退火30sec,72℃延

伸30sec,35个循环；72℃延伸7min。

表1检测用特异引物

引物名称引物序列引物浓度预期产物长度

上游引物5’-GACGTTTTAGTTAGAGCAC-3’

μ

10mol/L230bp

下游引物5-AATGGCACTGAAG