蛋白质溶液的浓缩方法.ppt

*3.2操作过程油面一定不能低于油镜的中线。严禁无油或低油位开启真空泵。第26页,共37页，星期六，2024年，5月*4.1原理4.2超滤装置及类型4.超滤法4.3超滤膜的选择4.4注意事项第27页,共37页，星期六，2024年，5月*4.1原理超滤（Ultrafiltration）技术是一种膜滤法，也有错流过滤（CrossFiltration）之称。其基本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质和微粒子如蛋白质、水溶性高聚物、细菌等被滤膜阻留，从而达到分离、分级、纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术。实验室常用超滤管和冷冻离心机，实现蛋白质溶液的超滤浓缩。第28页,共37页，星期六，2024年，5月*4.2装置及类型第29页,共37页，星期六，2024年，5月*4.2装置及类型超滤装置装置较简单，只是在密闭的容器中施加一定压力，使小分子和溶剂分子挤压出膜外。无搅拌装置浓差极化严重，只适于浓度较稀的少量超滤。超滤装置位于电磁搅拌器之上。向容器内施加压力的同时开动磁力搅拌器，大分子向滤膜表面堆积时，被电磁搅拌器分散到溶液中。浓度极化较弱，超滤速度略有提高。在一支空心柱内装有许多中空纤维毛细管，两端相通，管的内径一般在0.2mm左右，有效面积可以达到1平方厘米。极大地提高了超滤速度。搅拌式超滤无搅拌式超滤中空纤维超滤第30页,共37页，星期六，2024年，5月*4.3超滤膜的选择超滤技术的关键是膜。常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来为适应制药和食品工业上灭菌的需要，发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，若使用恰当，能连续用1～2年。暂时不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％叠氮化钠NaN3中保存。第31页,共37页，星期六，2024年，5月*超滤膜相对流速(ml/min/cm2)性能特点聚醚砜，pH范围1~143,000MWCO0.05肽的回收率高5,000MWCO0.24肽的回收率高，流速较快10,000MWCO0.41应用范围广，流速快，吸附低30,000MWCO0.41应用范围广，流速快50,000MWCO0.45精确的截留分子量限100,000MWCO0.35免疫球蛋白的收率高三醋酸纤维素，pH范围4~85,000MWCO0.04去除肽和蛋白10,000MWCO0.11微小组分，游离/结合药物研究20,000MWCO0.58样品清洗，HPLC样品制备再生纤维素，pH范围3~1110,000MWCO0.18微克量蛋白质的高效回收30,000MWCO0.58免疫球蛋白的快速和高效回收100,000MWCO0.40蛋白质梯度分离Hydrosart，pH范围3~115,000MWCO0.14稀释液的高效回收10,000MWCO0.27流速快，收率高，吸附低30,000MWCO0.48免疫球蛋白的收率高4.3超滤膜的选择第32页,共37页，星期六，2024年，5月*4.3超滤膜的选择不同截留分子量(MWCO)的超滤膜选择指南应用/分子量5,00010,00030,00050,000100,000酶XX生长因子XX免疫球蛋白XXX单克隆抗体XXX肽X第33页,共37页，星期六，2024年，5月*4.4注意事项料液流速温度操作压力影响因素进料浓度运行周期料液的预处理膜的清洗洗脱量超滤膜孔径大小第34页,共37页，星期六，2024年，5月*4.4注意事项提高超滤收率方法（样品在微克级别）： （1）根据样品处理量，选择最小可用的超滤容器，在小容器中反复添加样品，反复超滤。 （2）在适量范围内，选截留分子量最低的超滤膜。 （3）如可能，使用水平转头代替角转头离心，这样可减少在离心过程中溶液与离心管接触的表面积。 （4）将压力或离心力降低到大约最大推荐数值的一半。 （5）避免过度浓缩，最终体积越小，越难得到完全回收，如可能，在第一次回收后，用一滴或多滴缓冲液润洗容器，然后再次回收。 （6）用溶于蒸馏水中的5%SDS、Tween20或TritonX预先浸泡超滤容器过夜，然后